Her beskriver vi en metode for å indusere meningokokk meningitt gjennom en intracisternal ruten av infeksjon i voksen mus. Vi presenterer en trinnvis protokoll for meningokokkinfeksjon fra utarbeidelse av inokulum til intracisternal infeksjon; deretter registrere dyret overlevelse og evaluere bakteriell belastninger i murine vev.
Neisseria meningitidis (meningokokker) er en smal-Host-Range mikroorganismen, globalt anerkjent som den ledende årsaken til bakteriell meningitt. Meningokokker er en forbigående colonizer av menneskelig nasopharynx på ca 10% av sunne faget. Spesielt forhold, får den en invasiv evne til å trenge gjennom slimhinnene barriere og invaderer blodet forårsaker septicaemia. I det siste tilfellet, kan Fulminant sepsis oppstå selv uten påfølgende utvikling av hjernehinnebetennelse. Omvendt, bakterier kan dårlig formere seg i blodet, krysse blod hjerne barrieren, nå sentralnervesystemet, som fører til Fulminant hjernehinnebetennelse. Den murine modeller av bakteriell meningitt representerer et nyttig verktøy for å undersøke Host-patogen interaksjoner og å analysere pathogenetic mekanismer ansvarlig for denne dødelige sykdommen. Selv om flere eksperimentelle modellsystemer har blitt evaluert de siste ti årene, ingen av disse var i stand til å reprodusere de karakteristiske patologiske hendelsene i meningokokksykdom. I denne eksperimentelle protokollen, beskriver vi en detaljert prosedyre for induksjon av meningokokk hjernehinnebetennelse i en musemodell basert på intracisternal inoculation av bakterier. Den særegne tegn på menneskelig meningitt ble registrert i murine vert gjennom vurdering av kliniske parametre (f. eks, temperatur, kroppsvekt), evaluering av overlevelse, Mikrobiologisk analyse og histologiske undersøkelse av hjerneskade. Når du bruker intracisternal (i. cist.) inokulum, meningococci komplett levering direkte inn i Cisterna magna, fører til en svært effektiv meningokokk replikering i hjernevevet. En 1 000-fold økning av levedyktig antall bakterier er observert i ca 18 h. Videre er meningococci også funnet i milten, og lever av infiserte mus, noe som tyder på at leveren kan representere et mål organ for meningokokk replikering.
Neisseria meningitidis er et gram negativ β-proteobacterium begrenset til den menneskelige vert, kjent for å være en av de vanligste årsakene til hjernehinnebetennelse og sepsis i den menneskelige befolkning over hele verden. Det overvekst den øvre luftveiene (nese og hals) av sunne og asymptomatisk bærere (2-30% av befolkningen), men bakterien noen ganger omgår ulike vert immunforsvar og sprer seg fra blodet til hjernen forårsaker en ukontrollert lokal betennelse, kjent som meningokokk hjernehinnebetennelse. En kombinasjon av vert og bakterielle faktorer ser ut til å bidra til overgangen fra Commensal til invasiv atferd1.
N. meningitidis er spesialisert utelukkende i menneskelig kolonisering og infeksjon. Den har en smal rekke og har derfor begrenset in vivo patogenesen studier på grunn av mangelen på egnede dyremodeller som reproduserer den menneskelige meningokokksykdom. Som et resultat, hadde det ført til grunnleggende hull i forståelsen om patogenesen av septikemi og hjernehinnebetennelse forårsaket av meningokokker. I de siste ti årene tillot utviklingen av mange in vitro-systemer identifikasjonen av flere meningokokk virulens faktorer2,3,4. Selv om disse verdifulle studiene ga viktig innsikt for å forstå rollen til disse faktorene for en vellykket meningokokkinfeksjon, tillot ikke disse modellene vurdering av konsekvensene av bakteriell interaksjon med humoral og mobilnettet immunsystem og enda mindre med hele vevet. In vivo dyremodeller av infeksjon er av stor relevans i tillegg til evaluering av beskyttelsesgrad gitt av vaksine formuleringer. Som et menneske-Tropic patogen, meningokokker besitter nødvendige faktorer som er nødvendige for vellykket infeksjon som overflatestrukturer (dvs. type IV Pili og dekkevne proteiner) og jern opptak systemer for menneskelige reseptorer og transport proteiner (dvs. transferrin og Laktoferrin)5,6,7 til riktig overholde, overleve og invadere den menneskelige verten. Til slutt bidrar den genetiske variasjonen evnene til patogen til å unngå og/eller blokkere den menneskelige immunresponsen videre til de høyeartene tropism. Derfor, fravær av spesifikke vert faktorer, involvert i samspillet, kan blokkere trinn av patogene livssyklus, etablere betydelige vanskeligheter i utviklingen av små dyremodeller som oppsummerer meningokokk livssyklus.
I løpet av de siste ti årene har flere tilnærminger blitt utviklet for å forbedre vår forståelse av meningokokk smittsomme syklus. Infeksjoner av to dyremodeller, mus og rotte, enten intraperitonealt (IP) eller intranasalt (i.n.), ble utviklet for å reprodusere meningokokksykdom10,11,12,13,14 ,15,16,17. Laboratoriet musen er trolig en av de mer allsidige dyr for inducing eksperimentell meningokokkinfeksjon.
Imidlertid fører den IP måten av smitte til utvikling av alvorlig sepsis selv om det ikke etterligner den naturlige ruten for smitte, mens den i.n. ruten av infeksjonen var nyttig å evaluere meningokokk patogenesen, selv om det kan indusere lungeinfeksjon før sepsis10,11,12,13,14,15,16,17.
Den IP muse modellen var medvirkende til å vurdere beskyttelsen fra meningokokk Challenge10,11,12. Musen modell av meningokokk kolonisering basert på den i.n. ruten av infeksjonen har blitt utviklet med spedbarn mus, som de er mer utsatt for meningococci, å reprodusere en invasiv infeksjon etterligne løpet av meningokokksykdom hos mennesker 13,14,15,16,17. Videre, for å fremme meningokokk replikering i murine vert, et økende antall tekniske strategier ble også brukt, inkludert administrering av jern til dyrene for å forbedre infeksjonen, bruk av høy bakteriell inokulum, mus-passert bakteriell stamme samt ansettelse av spedbarn eller immunsupprimerte dyr vertene10,13,15,18,19. Uttrykk for konkrete menneskelige faktorer som CD4620 eller transferrin21 har økt mottakelighet av mus til denne menneske-Tropic bakterien; sysselsettingen av den menneskelige huden xenograft modell av infeksjonen har også vært nyttig å evaluere vedheft evne til meningococci til menneskelig endotelet22,23. Samlet sett har den nylige utviklingen av humanisert transgene mus forbedret forståelsen av meningokokk patogenesen og dens verts interaksjoner.
Tidligere har vi utviklet en murine modell av meningokokk hjernehinnebetennelse der inoculation av bakterier ble utført i Cisterna magna av voksne mus med mus-passert bakterier24. Kliniske parametre og overlevelse av infiserte mus viste opprettelsen av hjernehinnebetennelse med egenskaper som kan sammenlignes med de som er sett i den menneskelige verten, samt mikrobiologisk og histologiske analyse av hjernen. Fra disse infiserte mus, var bakterier, også, utvinnes fra blod, lever og milt, og bakteriell belastninger fra perifere organer korrelert med smittsomme dosen. Spesielt ble denne modellen benyttet for å evaluere virulens av en isogenic mutert stamme som var defekt i L-glutamat transporter GltT24. Nylig, ved hjelp av vår mus modell av meningokokk meningitt basert på i. cist. rute med serogruppe C stamme 93/42862,24 og en isogenic mutant defekt i cssA gen koding for UDP-N-acetylglucosamine 2-epimerase25, har vi analysert rollen som eksponert Sialic syre i etableringen av sykdom hos mus.
I denne protokollen, beskriver vi en grei metode for å indusere eksperimentell meningokokk hjernehinnebetennelse basert på i. cist. smitte ruten i Balb/c voksen mus. Denne metoden er spesielt nyttig for karakterisering av meningokokkinfeksjon i en murine vert, samt for vurdering av virulens mellom vill type referansestammer og isogenic mutanter. Den intra-cisternal ruten av infeksjonen sikrer fullstendig levering av meningococci direkte inn i Cisterna magna, som igjen forenkler bakteriell replikering i spinalvæsken (CSF) og induserer hjernehinnebetennelse med funksjoner som etterligner de tilstede hos mennesker2,24,25,26.
I denne studien, beskriver vi en eksperimentell protokoll for å indusere meningokokk hjernehinnebetennelse i voksen mus av i. cist. inoculation av meningokokk bakterier. Til vår kunnskap, har ingen annen modell av meningokokk hjernehinnebetennelse blitt utviklet i laboratoriet mus smittet av i. cist. rute i det siste, har denne måten blitt utforsket for å gi modeller av meningokokk hjernehinnebetennelse i både rotte31 og kanin32. Det er velkjent at den høyeste frekven…
The authors have nothing to disclose.
Studiene ble støttet delvis av PRIN 2012 [Grant Number 2012WJSX8K]: “Host-mikrobe interaksjon modeller i slimhinne infeksjoner: utvikling av romanen terapeutiske strategier” og av PRIN 2017 [2017SFBFER]: “en integrert tilnærming til å takle samspillet mellom tilpasning, stressende forhold og resistens resistens av utfordrende patogener “.
1,8 Skirted Cryovial With external thread | Starlab | E3090-6222 | |
50ml Polypropylene Conical Tube | Falcon | 352070 | 30 x 115mm |
Adson Forceps | F.S.T. | 11006-12 | Stainless Steel |
Alarm-Thermometer | TESTO | 9000530 | |
BactoTM Proteose Peptone | BD | 211693 | |
BD Micro Fine syringe | BD | 320837 | U-100 Insulin |
BD Plastipak syringe 1ml 25GA 5/8in | BD | 300014 | 05x16mm |
BD Plastipak syringe 5ml | BD | 308062 | 07 x 30mm |
BIOHAZARD AURA B VERTICAL LAMINAR FLOW CABINET | Bio Air s.c.r.l. | Aura B3 | |
BioPhotometer | Eppendorf | Model #6131 | |
Bottle D | Tecniplast | D | Graduated up to:400ml, Total Volume 450ml, 72x72x122mm |
C150 CO2 Incubator | Binder | 9040-0078 | |
Cage Body Eurostandard Type II | Tecniplast | 1264C | 267x207x140mm, Floor area 370cm2 |
Cell Culture Petri Dish With Lid | Thermo Scientific | 150288 | Working Volume: 5mL |
Centrifuge | Eppendorf | Microcentrifuge 5415R | |
Cuvetta semi-micro L. Form | Kartell S.p.A. | 01938-00 | |
di-Potassium hydrogen phosphate trihydrate | Carlo erba | 471767 | |
di-Sodium hydrogen phosphate anhydrous ACS-for analysis | Carlo Erba | 480141 | g1000 |
Diete Standard Certificate | Mucedola s.r.l. | 4RF21 | Food pellet for animal |
Dumont Hp Tweezers 5 Stainless Steel | F.S.T. by DUMONT | AGT5034 | 0,10 x 0,06 mm tip |
Electronic Balance | Gibertini | EU-C1200 | Max 1200g, d=0,01g, T=-1200g |
Eppendorf Microcentrifuge tube safe-lock | Eppendorf | T3545-1000EA | |
Erythromycin | Sigma-Aldrich | E-6376 | 25g |
Extra Fine Bonn Scissors | F.S.T. | 14084-08 | Stainless Steel |
Filter Top (mini- Isolator), H-Temp with lock clamps | Tecniplast | 1264C400SUC | |
GC agar base | OXOID | CM0367 | |
Gillies Forceps 1 x2 teeth | F.S.T. | 11028-15 | Stainless Steel |
Glicerin RPE | Carlo Erba | 453752 | 1L |
Graefe Forceps | F.S.T. | 11052-10 | Serrated Tip Width: 0.8mm |
Inner lid | Tecniplast | 1264C116 | |
Iron dextran solution | Sigma-Aldrich | D8517-25ML | |
Ketamine | Intervet | ||
Microbiological Safety Cabinet BH-EN and BHG Class II | Faster | BH-EN 2004 | |
Microcentrifuge tubes 1.5ml | BRAND | PP780751 | screw cap PP, grad |
Mouse Handling Forceps | F.S.T. | 11035-20 | Serrated rubber; Gripping surface:15 x 20 mm |
Mucotit-F2000 | MERZ | 61846 | 2000ml |
Natural Latex Gloves | Medica | M101 | |
New Brunswick Classic C24 Incubator Shaker | PBI international | C-24 Classic Benchtop Incubator Shaker | |
Petri PS Dishes | VWR | 391-0453 | 90X14.2MM |
Pipetman Classic P20 | Gilson | F123600 | 2-20microL |
Pipetman Classic P200 | Gilson | F123601 | 20-200microL |
Pipetman Classim P1000 | Gilson | F123602 | 200-1000microL |
Polyvitox | OXOID | SR0090A | |
Potassium Chloride | J.T. Baker Chemicals B.V. | 0208 | 250g |
Potassium Dihydrogen Phosphate | J.T. Baker Chemicals B.V. | 0240 | 1Kg |
PS Disposible forceps | VWR | 232-0191 | |
Removable Divider | Tecniplast | 1264C812 | |
Round-Bottom Polypropylene Tubes | Falcon | 352063 | 5ml |
Sodium Chloride | MOLEKULA | 41272436 | |
SS retainer and Polyester FilterSheet | Tecniplast | 1264C | |
Standard Pattern Forceps | F.S.T. | 11000-12 | Stainless |
Stevens Tenotomy Scissors | F.S.T. | 14066-11 | Stainless Steel |
Surgical Scissor – ToughCut | F.S.T. | 14130-17 | Stainless |
Touch N Tuff disposible nitrile gloves | Ansell | 92-500 | |
Ultra Low Temperature (ULT) Freezer | Haier | DW-86L288 | Volume= 288L |
Wagner Scissors | F.S.T. | 14070-12 | Stainless Steel |
Xylazine | Intervet |