Adoptiv immunterapi av iNKT-celler i glukos-6-fosfatisomeras (G6PI)-inducerad RA Möss
Summary
Detta protokoll använder G6PI blandade peptider för att konstruera reumatoid artrit modeller som är närmare den mänskliga reumatoid artrit i CD4+ T celler och cytokiner. Hög renhet invariant naturlig mördare T-celler (främst iNKT2) med specifika fenotyper och funktioner erhölls genom in vivo induktion och in vitro rening för adoptiv immunterapi.
Abstract
Reumatoid artrit (RA) är en komplex kronisk inflammatorisk autoimmun sjukdom. Patogenesen vid sjukdomen är relaterad till invariant naturliga mördare T (iNKT) celler. Patienter med aktiv RA presenterar färre iNKT-celler, defekt cellfunktion och överdriven polarisering av Th1. I denna studie, en RA djurmodell fastställdes med hjälp av en blandning av hGPI325-339 och hGPI469-483 peptider. INKT-cellerna erhölls genom induktion och in vitro-rening, följt av infusion till RA-möss för adoptivimmunterapi. Den in vivo imaging system (IVIS) spårning visade att iNKT celler huvudsakligen distribuerades i mjälte och lever. Dag 12 efter cellbehandling avtog sjukdomsprogressionen signifikant, de kliniska symtomen lindrades, överflödet av iNKT-celler i brässökade, andelen iNKT1 i brässminskade och nivåerna av TNF-α, IFN-γ och IL-6 hos serumet minskade. Adoptiv immunterapi av iNKT-celler återställde balansen i immunceller och korrigerade den överdrivna inflammationen i kroppen.
Introduction
Reumatoid artrit (RA) är en autoimmun sjukdom som kännetecknas av kronisk, progressiv invasivitet med 0,5–1% incidens1,2. Den underliggande patogenesen tillskrivs den onormala spridningen av autoreaktiva CD4+ och CD8+ T-celler, manifesteras av en ökning av andelen CD4+IFN-γ+ och CD4+IL-17A+ T-celler, och det minskade antalet CD4+IL-4+ och CD4+CD25+FoxP3+ T celler. Därför ökar utsöndrandet av inflammatoriska cytokiner, och en överdriven inflammatorisk reaktion förstör den inhemska balansen och toleransfunktionen i kroppens immunsystem. Dessutom, hjälparen T-lymfocyter (Th) 1 celler som tränger in i leden förvärra den inflammatoriska reaktionen och ledskador. Därför är hämning av överdriven inflammatorisk reaktion och återställande av immuntolerans och immunbalans nyckeln till behandling av RA3,4.
INKT-cellerna har både NK-cell- och T-cellfunktioner och egenskaper. INKT-cellerna hyser en distinkt, invariant T-cellsreceptor (TCR) α-kedja med begränsad TCR β-kedja repertoar5 och känner igen glykolipidantigenet som presenteras av det större histokompatibilitetskomplexet (MHC) klass I-molekylen CD1d på ytan av de antigenpresenterande cellerna. Mitsuo et al.6 upptäckte ett stort antal iNKT-celler och funktionella defekter vid många autoimmuna sjukdomar, inklusive RA. Aurore et al.7 visade att iNKT-celler har en positiv effekt på att upprätthålla autoimmun tolerans och att när antalet och funktionen hos iNKT-celler återställs lindras sjukdomen. Dessutom fann Miellot-Gafsou et al.8 att iNKT celler inte bara upphävs sjukdomen utan också ökat utvecklingen av sjukdomen. Dessa motstridiga resultat tyder på att iNKT-celler är heterogena T-celler, och funktionen hos olika undergrupper kan vändas. I en klinisk studie av RA korrelerade frekvensen av iNKT-celler med poängen för sjukdomsaktiviteten9. Resultaten bekräftade också att frekvensen av iNKT minskade hos RA-patienter, antalet CD4+IFN-γ+ T-cellundergrupper ökade och sekretoriska nivåer av inflammatoriska cytokiner IFN- γ och TNF- α ökade10,11. Dessutom undersökte Sharif et al.12 typ 1-diabetes (T1D) och fann att selektiv infusion av iNKT-celler uppreglerade uttrycket av den inflammatoriska cytokinEN IL-4, bibehållen immuntolerans och förhindrade utvecklingen av typ 1-diabetes. Därför ökar adoptivinfusion av specifika iNKT-celler eller riktad aktivering av iNKT-celler nivån av iNKT-celler hos RA-patienter, vilket kan vara ett genombrott vid RA- behandling.
Cellulär immunterapi är för närvarande av stort intresse och har använts i stor utsträckning i cancerbehandling. INKT-celler är dock sällsynta, heterogena immunoregulatory celler (endast 0,3% av det totala antalet PBMCs)13, vilket begränsar potentiella kliniska tillämpningar. Dessa celler är huvudsakligen indelade i tre subpopulationer: 1) iNKT1 celler, som har ett högt uttryck för promyelocytisk leukemi zink-finger protein (PLZF) och T-box transkription faktor (T-bet); 2) iNKT2 celler med mellanliggande uttryck för PLZF och GATA bindande protein 3 (GATA3); 3) iNKT17-celler med lågt uttryck för PLZF och retinoidrelaterad särnukleär receptor (ROR)-γt som utsöndrar IFN-γ, IL-4 och IL-1714. Aktiverade iNKT-celler utsöndrar Th1, Th2 och Th17-liknande cytokiner, som bestämmer de olika immunmodulerande effekterna av iNKT-celler15. Immunmodulerande och immunoterapeutiska effekterna av specifik aktivering av olika subpopulationer av iNKT celler är olika. Därför kan valet av specifika fenotyper av iNKT-celler (främst iNKT2) med antiinflammatoriska funktioner för att reglera kroppens immunsvar korrigera immunobalansen och immunsjukdomarna i RA.
Inrättandet av en idealisk djurmodell är av stor betydelse för behandling och studier av RA patogenes. För närvarande, de vanligaste och mogna djurmodeller inkluderar kollagen-inducerad artrit, adjuvans artrit, zymosan-inducerad artrit, och polysackarider-inducerad artrit16–17. Det finns dock ingen modell som helt kan simulera alla funktioner i mänskliga RA. Typ II kollagen-inducerad artrit (CIA) är en klassisk artrit modell. CIA induceras av immunisering av möss med typ II kollagen-specifika monoklonala antikroppar, vilket återspeglar antikroppsberoendet av denna sjukdommodell. Benurs et al. beskrev en modell med ett systemiskt immunsvar mot glukos-6-fosfatisomeras (G6PI), som inducerar perifer symmetrisk polyartrit i känsliga musstammar18,19. I denna modell beror utvecklingen av artrit på T-celler, B-celler och medfödd immunitet18,19,20. Horikoshi21 fann att RA-modeller till följd av immunisering av DBA/1 möss med G6PI polypeptidfragment är mer lika mänskliga RA i termer av CD4+ T-celler och cytokiner (dvs IL-6 och TNF-α) än CIA-modellerna. För att öka den stimulerande effekten på TCR erkännande webbplats, blandade polypeptid fragment av G6PI (hGPI325-339 och hGPI469-483) användes för att vaccinera DBA/1 möss för att konstruera RA musmodell. Framgången för detta tillvägagångssätt kan hög eftersom hGPI325-339 och hGPI469-483 är immundominanta för I-A q-begränsad T-cell svar. Därför kan denna modell simulera överproliferation av CD4+ T-celler och iNKT celldefekter hos RA-patienter22. Den grundläggande forskningen av RA immunopathology lade grunden för vår ytterligare fördjupade undersökning.
Protocol
Representative Results
Discussion
iNKT celler är speciella T-celler som överbryggar medfödda och adaptiva immunitet och är huvudsakligen utvecklade från CD4++/ CD8+ thymocytes. iNKT celler har olika immunoregulatory funktioner och interagera med andra immunceller genom direkt kontakt och utsöndring av olika cytokiner23, som påverkar dendritiska celler (DCs), makrofager, neutrofiler, B-celler, T-celler och NK cell differentiering och utveckling2<sup class=…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Vår studie stöddes av National Natural Science Foundation of China (NSFC) (81771755), Högskolor och universitetets vetenskap och teknik viktiga forskningsprojekt i Hebei-provinsen (ZD2017009) och Animal Lab of Medical Experiment Center, Hebei University. Vi är tacksamma för deras stöd.
Materials
| Alexa Fluor 647 Mouse Anti-PLZF | BD | 563490 | America |
| Anti-PE MicroBeads | Miltenyi | 130-048-801 | Germany |
| Columns | Miltenyi | MS | Germany |
| Cryogenic Centrifuge | Beckman | Allegra® X-15R | America |
| DiR | Thermo Fisher Scientific | D12731 | America |
| Embedding Center | Tianjin Aviation Electromechanical Co., Ltd. | BMJ-1 | China |
| FITC Hamster Anti-Mouse TCR β Chain | BD | 553170 | America |
| Flow cytometer | BD | Accuri C6 | America |
| Freund's complete adjuvant | Sigma | F5881 | America |
| hGPI325-339 (IWYINCFGCETHAML) | Karebay Biochem | 18062202 | China |
| hGPI469-483 (EGNRPTNSIVFTKLT) | Karebay Biochem | 18062203 | China |
| In Vivo Imaging System | PerkinElmer | caliper IVIS lumina II | America |
| Ionomycin Calcium | Cayman | 10004974 | America |
| KRN7000 | AdipoGen | AG-CN2-0013 | America |
| Mouse CD1d Tetramer-PE | MBL | TS-MCD-1 | Japan |
| Mouse percoll | Solarbio | P8620 | China |
| Optical Microscope | Olympus | Olympus-II | Japan |
| PerCP-CyTM5.5 Mouse anti-ROR-ϒt | BD | 562683 | America |
| PerCP-CyTM5.5 Mouse anti-T-bet | BD | 561316 | America |
| Pertussis toxin | Sigma | P7208 | America |
| phorbol esters | Cayman | 10008014 | America |
| Red Blood Cell Lysis Buffer | BD | 555899 | America |
| RPMI-1640 | Biological Industries | 01-100-1ACS | Israel |
| Th1/Th2/Th17 cytokines kit | BD | 560485 | America |
| Ultramicrotome | Leica | Leica EM UC6 | Germany |
References
- Tobón, G. J., Youinou, P., Saraux, A. The environment, geo-epidemiology, and autoimmune disease: Rheumatoid arthritis. Autoimmunity Reviews. 35 (1), 0 (2010).
- Cross, M., et al. The global burden of rheumatoid arthritis: estimates from the Global Burden of Disease 2010 study. Annals of the Rheumatic Diseases. 73 (7), 1316-1322 (2014).
- Kanashiro, A., Bassi, G. S., Queiróz Cunha, F. D., Ulloa, L. From neuroimunomodulation to bioelectronic treatment of rheumatoid arthritis. Bioelectronics in Medicine. 1 (2), 151-165 (2018).
- Brennan, P. J., Brigl, M., Brenner, M. B. Invariant natural killer T cells: an innate activation scheme linked to diverse effector functions. Nature Reviews Immunology. 13 (2), 101-117 (2013).
- Bianca, B. S. Unraveling Natural Killer T-Cells Development. Frontiers in Immunology. 8, 1950 (2018).
- Mitsuo, A., et al. Decreased CD161+CD8+ T cells in the peripheral blood of patients suffering from rheumatic diseases. Rheumatology. 45 (12), 1477-1484 (2006).
- Miellot, A., et al. Activation of invariant NK T cells protects against experimental rheumatoid arthritis by an IL-10-dependent pathway. European Journal of Immunology. 35 (12), 3704-3713 (2005).
- Miellot-Gafsou, A., et al. Early activation of invariant natural killer T cells in a rheumatoid arthritis model and application to disease treatment. Immunology. 130 (2), 296-306 (2010).
- Tudhope, S. J., Delwig, A. V., Falconer, J., Pratt, A., Ng, W. F. Profound invariant natural killer t-cell deficiency in inflammatory arthritis. Annals of the Rheumatic Diseases. 69 (10), 1873-1879 (2010).
- Ming, M., et al. Effects on immunoregulation of iNKT cells in RA by novel synthetic immunostimulator CH1b. Chinese Journal of Immunology. 32 (02), 218-222 (2016).
- Ming, M., et al. Study of the correlation between the percentage of iNKT cells and the ratio of IFN-γ/IL-4 in patients with rheumatoid arthritis. Chinese Journal of Microbiology Immunology. 35 (3), 213-218 (2015).
- Sharif, S., et al. Activation of natural killer T cells by α-galactosylceramide treatment prevents the onset and recurrence of autoimmune Type 1 diabetes. Nature Medicine. 7, 1057-1062 (2010).
- Gapin, L. Development of invariant natural killer T cells. Current Opinion in Immunology. 39, 68-74 (2016).
- Kwon, D. I., Lee, Y. J. Lineage Differentiation Program of Invariant Natural Killer T Cells. Immune Network. 17 (6), (2017).
- Thapa, P., et al. The differentiation of ROR-γt expressing iNKT17 cells is orchestrated by Runx1. Scientific Reports. 7 (1), 7018 (2017).
- Schurgers, E., Billiau, A., Matthys, P. Collagen-induced arthritis as an animal model for rheumatoid arthritis: focuson interferon-γ. Interferon Cytokine Research. 31 (12), 917-926 (2011).
- Van Haalen, H. G. M., Severens, J. L., Tran-Duy, A., Boonen, A. How cost-effectiveness A systematic review and stepwise approach for selecting a transferable health economic evaluation rheumatoid arthritis. Pharmacoeconomics. 32 (5), 429-442 (2014).
- Schubert, D., Maier, B., Morawietz, L., Krenn, V., Kamradt, T. Immunization with glucose-6-phosphate isomerase induces T cell-dependent peripheral polyarthritis in genetically unaltered mice. Journal of Immunology. 172, 4503-4509 (2004).
- Bockermann, R., Schubert, D., Kamradt, T., Holmdahl, R. Induction of a B-cell-dependent chronic arthritis with glucose-6-phosphate isomerase. Arthritis Research, Therapy. 7, 131613-131624 (2005).
- Kamradt, T., Schubert, D. The role and clinical implications of G6PI in experimental models of rheumatoid arthritis. Arthritis Research, Therapy. 7, 20-28 (2005).
- Horikoshi, M., et al. Activation of Invariant NKT Cells with Glycolipid Ligand α-Galactosylceramide Ameliorates Glucose-6-Phosphate Isomerase Peptide-Induced Arthritis. PlosOne. 7 (12), 51215 (2012).
- Zhang, X. J., et al. Immunization with mixed peptides derived from glucose-6-phosphate isomerase induces rheumatoid arthritis in DBA /1 mice. Chinese Journal of Pathophysiology. 32 (3), 569-576 (2016).
- Motohashi, S., Nakayama, T. Invariant natural killer T cell-based immunotherapy for cancer. Immunotherapy. 1 (1), 73 (2017).
- Jung, S., et al. The requirement of natural killer T-cells in tolerogenic APCs-mediated suppression of collagen-induced arthritis. Experimental and Molecular Medicine. 42 (8), 547-554 (2010).
- Luc, V. K., Lan, W. Therapeutic Potential of Invariant Natural Killer T Cells in Autoimmunity. Frontiers in Immunology. 9, 519-526 (2018).
- Chiba, A., et al. Suppression of collagen-induced arthritis by natural killer T cell activation with OCH, a sphingosine-truncated analog of α-galactosylceramide. Arthritis, Rheumatism. 50 (1), 305-313 (2004).
- Tudhope, S. J., Delwig, A. V., Falconer, J., Pratt, A., Ng, W. F. Profound invariant natural killer t-cell deficiency in inflammatory arthritis. Annals of the Rheumatic Diseases. 69 (10), 1873-1879 (2010).
- Bruns, L., et al. Immunization with an immunodominant self-peptide derived from glucose-6-phosphate isomerase induces arthritis in DBA/1 mice. Arthritis Research, Therapy. 11 (4), (2009).
- Parietti, V., et al. Rituximab treatment overcomes reduction of regulatory iNKT cells in patients with rheumatoid arthritis. Clinical Immunology. 134 (3), 331-339 (2010).
- Yoshida, Y., et al. Functional mechanism(s) of the inhibition of disease progression by combination treatment with fingolimod plus pathogenic antigen in a glucose-6-phosphate isomerase peptide-induced arthritis mouse model. Biological, Pharmaceutical Bulletin. 38 (8), 1120-1125 (2015).
- Chen, D., et al. Study of the adoptive immunotherapy on rheumatoid arthritis with Thymus-derived invariant natural killer T cells. International Immunopharmacology. 67, 427-440 (2019).
