Celle divisjoner kan vises i sanntid ved hjelp av fluorescensmerkete kodede proteiner og tidsforløp mikroskopi. Ved hjelp av protokollen som presenteres her, kan brukerne analysere celledeling timing dynamikk, mitotisk spindel montering, og kromosom congression og segregering. Defekter i disse hendelsene etter RNA interferens (RNAi)-mediert gen knockdown kan vurderes og kvantifisert.
Drosophila S2-celler er et viktig verktøy i å studere mitose i vev kultur, gir molekylær innsikt i denne fundamentale cellulære prosessen i en rask og høy gjennomstrømming måte. S2-celler har vist seg mottagelig for både fast-og live-Cell Imaging applikasjoner. Spesielt kan Live-celle Imaging gi verdifull informasjon om hvordan tap eller knockdown av et gen kan påvirke Kinetics og dynamikken i viktige hendelser under celledeling, inkludert mitotisk spindel montering, kromosom congression og segregering, så vel som total celle syklus timing. Her bruker vi S2-celler stabilt transfekterte med fluorescensmerkete merket mCherry: α-tubulin for å markere mitotisk spindelen og GFP: CENP-A (referert til som “CID”-genet i Drosophila) for å markere centromeren for å analysere virkningene av viktige mitotisk gener på tidspunktet for celle divisjoner, fra profase (spesielt på Nuclear konvolutt Breakdown; NEBD) til utbruddet av anaphase. Denne bilde protokollen gir også mulighet for visualisering av spindel mikrotubulinettverket og kromosom dynamikk gjennom mitose. Heri, vi har som mål å gi en enkel, men likevel omfattende protokoll som gjør at leserne enkelt kan tilpasse S2 celler for Live Imaging eksperimenter. Resultater innhentet fra slike eksperimenter bør utvide vår forståelse av gener som er involvert i celledelingen ved å definere sin rolle i flere samtidige og dynamiske hendelser. Observasjoner gjort i dette cellekultur systemet kan valideres og undersøkes ytterligere i vivo ved hjelp av den imponerende verktøykassen av genetiske tilnærminger i fluer.
Cell Division er en prosess som er kritisk for alle flercellede organismer, både i deres utvikling og homeostase1. Drosophila har lenge vært brukt som modell for studiet av celledeling, med eksperimenter i ulike vevstyper og genetiske tilstander som gir viktig innsikt i prosessen. Mens mange av disse innsikt kommer fra faste celle forhold, er celledeling en dynamisk prosedyre med mange bevegelige deler, noe som gjør visualisering av levende celler integrert for å vurdere RNAi eller genetisk knockout effekter på mange deler av celledeling, inkludert spindel dannelse, kromosom Kongressens og segregering, og cytokinesi.
Mange protokoller har blitt utviklet og benyttet gjennom årene for å visualisere Drosophila celle divisjoner in vivo. Ulike grupper har dyrket teknikker til bilde divisjoner i både larvestadiet imaginal plater og larvestadiet hjerner2,3,4,5,6,7,8 . Disse teknikkene, mens nyttig for Imaging i bestemte vev, er begrenset i gjennomstrømning og ofte krever generering og vedlikehold av genetiske aksjer for å generere fluorescerende komponenter og endre uttrykk for gener av interesse. Kultivert S2-celler fra Drosophila gir en høyere gjennomstrømning alternativ til raskt å teste effekten av ulike gener i celledeling. Videre, med evnen til å transfect ulike fluorescerende proteiner, kan S2-celler raskt endres for å bestemme effekten av RNAi-knockdown på en rekke komponenter i celledelingen. Fluorescensmerkete Tagged gener av interesse kan også observeres i celledeling, noe som åpner for dynamisk karakterisering av deres funksjon9.
Her gir vi en detaljert protokoll for Live Imaging av mitotisk S2 celler ved hjelp av metoder vi nylig har beskrevet10. Vår metode benytter stabilt transfekterte celler med fluorescerende markører for mikrotubuli og centromeres hvis uttrykk er under kontroll av en kobber-induserbart Promotor (metallothionein; pMT). Denne metodikken kan brukes til bilde spindel og kromosom dynamikk i alle faser av mitose utnytte en relativt enkel fluorescerende mikroskop med grunnleggende bildebehandling programvare. Det kan bli ytterligere tilpasset for å passe individuelle forskningsbehov, med forbigående transfeksjoner og RNAi som tilbyr utvidede muligheter for å bestemme rollen til kandidat gener i mitose. På grunn av den relative enkelheten i protokollen, kan den brukes for små-skala tap-of-Function-skjermer for å identifisere gener som videre studier in vivo ville være fordelaktig, noe som åpner for mer fokusert innsats og effektivitet med påfølgende genetiske manipulasjon i fluer.
Identifisere en passende celle
Nøkkelen til Imaging splitte S2 celler er først å finne den riktige cellen. Tid kan være bortkastet Imaging celler som er feilaktig antatt å være klar til å dele, men ikke klarer å gjøre det på en rimelig tidsramme. Celler må identifiseres som har to distinkte og synlige centrosomes og en intakt kjerne. Centrosomes må ha mikrotubulinettverket fibre som kommer fra dem, gi dem en “stjerne-lignende” utseende. En intakt nucleus brytning lys når du justerer fokus, og gjør også den omtrentlige midten av cellen mørkere i utseende. Kjernen vil også inneholde GFP: CID “prikker”, en annen særtrekk for å hjelpe i sin identifisering. Celler med > 2 centrosomes, tubulin puncta uten tubulin fibre som kommer fra dem, eller celler med bare én centrosome bør unngås. I tillegg, hvis to centrosomes er synlige, men en kjerne er ikke, har NEBD allerede skjedd og cellen er for langt avansert i sin divisjon for å bli avbildet hvis en komplett M-fase analyse er ønsket. En gang en passende cellen er grunnlegge, fart inne igangsetting tenkelig er avgjørende idet NEBD hender rask (karakteristisk innen 3-5 min.) og forsinkelsen starten av tenkelig kanne føre til savnet Opportunities. Fokuser cellen i bildebehandlingsprogrammet raskt slik at begge centrosomes er synlige, eller hvis centrosomes er ute av flyet med hverandre, sett fokuspunktet mellom de to, slik at hver kan fanges når Z stabler er samlet over og under den definerte senter Punkt. En gang fokusere, med det samme sette forskyvningen imellom fasen og det bo cellen kammeret overflate benytter det Infrared fokusere sjekk (hvis anvendelig) og begynne det tenkelig program. Selv om protokollen som presenteres her er spesielt skreddersydd for eksperimenter som vurderer NEBD-til-anaphase dynamikk, kan enkle modifikasjoner passe leserne som studerer alternative mitotisk hendelser. For NEBD-til-metafase-og anaphase-til-telophase-avbildning foreslår vi 10 s bilde opptaks intervaller ettersom disse prosessene er svært dynamiske og forekommer raskt i S2-celler (5-10 min). Metafase-to-anaphase overgang (vår typiske eksperimentelle fokus) er en lengre prosess (20-30 min) i S2-celler, og vi samler inn bilder med 30 s intervaller. Endelig, telophase-through-cytokinesi skjer ganske langsomt i S2-celler, og vi foreslår 60 s intervaller som gir nok oppløsning for denne omtrentlige time lange prosessen.
Opprettholde fokus gjennom Imaging program
Hvis en infrarød fokus kontrollenhet ikke er tilgjengelig, må du unngå å dunk mikroskopet eller tabellen den sitter på, da dette kan føre til at cellen går ut av fokus under bildebehandlingsprogrammet, noe som fører til tvetydige, ikke-interpretable resultater. Pre-coating den levende cellen kammer brønner med Poly-L-lysin kan hjelpe i celle etterlevelse, som kan bidra til å unngå celle bevegelse og er spesielt nyttig for oppsett uten infrarød fokus sjekker. I tillegg kan oppsett inkludert støtabsorberende plattformer eller luft tabeller bidra til å unngå at cellene beveger seg ut av fokus. Til slutt, noen programmer har pause funksjoner som tillater brukeren å fokusere på og gjenoppta programmet.
Imaging flere celler
Nyttig å akkumulering av data er at ofte flere celler klare til å dele kan plasseres innenfor samme synsfelt for Imaging. Dette kan være spesielt nyttig for eksperimenter der celler har lang M-fase varigheter eller langvarig arrestasjon (f.eks. betingelser som induserer aktivering av SAC). For disse cellene, vi vanligvis bildet til cellene er photobleached (ca 2-3 h), men full timing av arresterte celler bør være på skjønn av forskeren. Noen ganger kan flere pre-splitte celler være i forskjellige fokal plan, i så fall kan det være nyttig å legge til z-stabler for å imøtekomme alle celler. Å legge til flere z-stabler kan også bidra til å forbedre oppløsningen. Forsiktighet bør utvises ved å gjøre dette, men som det vil utsette celler til mer stråling og føre til raskere photobleaching, samt føre til store filstørrelser på harddisken lagringsenheter.
Unngå Photobleaching og Phototoksisitet
Vår metode beskriver spesifikke innstillinger for eksponeringstider, bilde intervaller, z-stabler og prosent transmisjon for vår LED-lyskilde som generelt fungerer for vårt eksperimentelle oppsett og ønskede resultater. Som mikroskop og eksperimentelle mål kan variere, hva som kan fungere godt for vårt system kan føre til prematur photobleaching eller Phototoksisitet i andre. Photoskade kan utgjøre en mangel på spindel bevegelse, mikrotubulinettverket fragmentering, defekt mikrotubulinettverket dynamikk, og forlenget spindel kontrollpunkt aktivering. En potensiell metode for å unngå slike fallgruver er å begrense eksponeringstiden. De fleste moderne kameraer har nå brede dynamiske områder, og histogrammer kan justeres for å visualisere strukturer selv ved svært lave eksponeringer. En annen teknikk er å øke bildebehandlings intervallet (f.eks. til flere minutter mellom bilder) slik at antall ganger en celle utsettes for lys over et totalt innsamlings intervall reduseres. Dette er fordelaktig spesielt i Imaging for lengre perioder av gangen (mange timer), og kan i tillegg bidra til å redusere filstørrelsen på slike eksperimenter. Begrense antall z stabler tatt kan også bidra til å redusere lys eksponering, ved hjelp av 2 eller bare 1 i stedet for 3. Videre justere prosent Transmisjon av lys (for LED lyskilder), eller bruk av nøytral tetthet (ND) filtre (for både halogen lampe og LED lyskilder) vil redusere lysstyrken og kombinert med lengre eksponeringstider kan bevare synligheten . Ved å velge celler med centrosomes allerede separert, kan generell eksponering begrenses ved at disse cellene vanligvis inn mitose raskt (innen et minutt eller to) etter begynnelsen Imaging. Man kan også begrense tiden som cellene får lov til å bli avbildet før NEBD. Vår Lab vanligvis setter denne gangen på 10 min, men en mer konservativ grense kan lett bli pålagt av brukeren. I tillegg er en mer “invasiv” måle vi anbefaler behandling med dsRNA rettet mot en del av SAC (som Rod eller Mad2). Hvis en arrest fenotype skyldes ikke-spesifikk celle skade (f. eks, defekt mikrotubulinettverket dynamikk), er en slik behandling mindre sannsynlighet for å undertrykke arrestasjonen i forhold til en bona fide effekt av genet av interesse i det opprinnelige eksperimentet.
Future veibeskrivelse
Metoden beskrevet her kan utnyttes på en relativt enkel epifluorescent mikroskop for å raskt bilde Live celle divisjoner og kan lett tilpasses for å passe en forsker spesielle eksperimentelle design og mål. Flere gode metoder for dyrking, RNAi knockdown tilnærminger, transient transfeksjoner, og fluorescens mikroskopi har blitt publisert for S2 og andre Drosophila celler9,14,15, 16 flere , 17. vår protokoll tilbyr et par fordeler. (1) bruk av en dobbel stabil cellelinje (GFP: CID, mCherry: α-Tubulin) markerer samtidig to viktige mitotisk strukturer, unngår stresset og potensielle komplikasjoner av forbigående transfeksjoner, og sikrer at nesten alle celler vil uttrykke fluorescerende markører som potensielle kandidater for bildebehandling. (2) tilpasningen til mitose legger til publiserte protokoller undersøke cytoskjelettkomponenter dynamikk i aktive, ikke-dele celler og strekker seg til å undersøke mitotisk hendelser i sanntid. Selv om vi tror vår er en kraftig teknikk som legger til repertoaret av andre, kan det alltid være forbedringer gjort. Et bestemt område av celledeling som vi har funnet vanskelig å image er centrosome divisjon. Dette skjer før NEBD og det er vanskelig å avgjøre når en enkelt centrosome er klar til å skille i to. Bruke fluorescerende celle syklus markører (cyclin A og cyclin B) kan bidra til å løse dette problemet, men kommer på bekostning av kanaler som kan brukes til å visualisere celledeling komponenter. Vår beste strategi for å forsøke å visualisere centrosome divisjon er å legge multipunkt oppkjøpet til tenkelig program (definere ulike punkter i XY flyet til bildet), men dette kan resultere i store filer, og kan også kreve (avhengig av antall poeng) øke intervallet mellom bilde samlingen og redusere tids oppløsningen på den resulterende filmen. En annen løsning kan være synkronisering av celler på en ønsket celle syklus scene ved hjelp av medikamenter som mål celle syklus regulatorer etterfulgt av påfølgende bleke før Imaging, selv om disse metodene ikke kan være pålitelig i S2-celler spesielt.
Protokollen som presenteres her gir et grunnlag for fremtidige applikasjoner i live celle Imaging også. Med forbedret bildebehandling og programvareteknologi, virkelig høy gjennomstrømning tilpasninger av denne protokollen ved hjelp av høyere kapasitet, multi-kamret plater kan være mulig. Slike innovasjoner ville gjøre store RNAi skjermer, slik som de allerede oppnådd i faste forberedelser12,18, mer medgjørlig i et levende celleformat. Små molekyl narkotika skjermer kan også være seg som et middel til å identifisere romanen forbindelser rettet mot celledeling prosesser. Forbedring av fluorophores og optiske filtre kan også føre til Imaging av flere mitotisk komponenter (ikke bare de to vi beskriver), slik at Imaging av spesifikke mitotisk regulatorer og deres interaksjon med DNA og/eller spindelen. For eksempel generere celler med fluorescerende journalister som uttrykker følgende DNA skade eller under apoptose ville være nyttig verktøy for å identifisere romanen gener involvert i disse prosessene. Lignende tilnærminger kan brukes til å undersøke celle syklus dynamikk ved hjelp av uttrykk for fluorescensmerkete merket cyclins19.
The authors have nothing to disclose.
Dette arbeidet ble finansiert av National Institutes of Health (R01 GM108756). Vi er takknemlige for Gary karpen (University of California, Berkeley) for sjenerøst å gi oss en GFP: CID S2 cellelinje lager som vår GFP: CID/mCherry: αTubulin linje ble generert10.
Bright-Line Hemacytometer | Sigma-Aldrich | Z359629-1EA | for cell counting |
cellSens imaging software | Olympus | ||
CELLSTAR Cell Culture Flask, 50ML, 25 CM2, PS, Red Filter Screw Cap, Clear, Sterile, 10PCS/BAG | Greiner Bio-One | 690175 | |
CELLSTAR Cell Culture Multiwell Plate, 6 well, PS, Clear, TC, Lid with condensation rings, sterile, single packed | Greiner Bio-One | 657160 | |
Centrifuge 5804 R | eppendorf | Cat. 022623508 | |
Copper(II) sulfate pentahydrate, minimum 98% | Sigma-Aldrich | C3036-250G | |
Corning Fetal Bovine Serum | Fisher Scientific | MT35015CV | |
Effectene Transfection Reagent 1 mL | Qiagen | 301425 | for transient transfection |
IX-83 Inverted Epifluorescent Microscope | Olympus | ||
LabTek Chambered Slide Insert | Applied Scientific Instruments | I-3016 | |
MEGAscript T7 Transcription Kit | Thermo Fisher Scientific | AM1334 | For dsRNA production |
MOXI Z Mini Automated Cell Counter Kit | ORFLO | MXZ001 | for cell counting |
MS-2000 XY Flat-Top Automated Stage and Controller | Applied Scientific Instruments | ||
Nunc Lab-Tek II Chambered Coverglass (no 1.5 borosilicate glass) 8-well | Thermo Fisher Scientific | 155409 | |
Orca-Flash 4.0 LT Camera | Hammamatsu Photonics K.K. | C11440-42U | |
pMT/V5-His A Drosophila Expression Vector | Thermo Fisher Scientific | V412020 | |
Poly-L-Lysine | Cultrex | 3438-100-01 | |
Purifier Logic+ Class II, Type A2 Biosafety Cabinets | Labconco | 302310000 | |
Schneider's insect medium | Sigma-Aldrich | S0146-100ML | |
Spectra Tub Centrifuge Tubes | VWR | 470224-998 | |
Uner Counter BOD Incubator | Sheldon manufacturing (VWR) | 89409-346 | |
X-CITE 120 LED | ExcelitasTechnologies | Led light source | |
Z -Drift Compensator (ZDC) | Olympus | infrared focus check |