इस प्रोटोकॉल विच्छेदन और माउस मॉडल से कपाल तंत्रिका शिखर कोशिकाओं की संस्कृति का वर्णन, मुख्य रूप से सेल प्रवास के अध्ययन के लिए. हम लाइव इमेजिंग तकनीकका इस्तेमाल किया और गति और सेल आकार परिवर्तन के विश्लेषण का वर्णन.
पिछले कई दशकों में मानव रोगों की नकल करने के लिए इस्तेमाल आनुवंशिक रूप से संशोधित माउस मॉडल की उपलब्धता में वृद्धि हुई है। हालांकि, कोशिका आंदोलनों और विवो में भेदभाव का अध्ययन करने की क्षमता अभी भी बहुत मुश्किल है. न्यूरोक्रिस्टोपैथीज, या तंत्रिका शिखर वंश के विकार, विशेष रूप से प्रमुख भ्रूण चरणों की पहुंच की कमी और आसन्न मेसोडरमल मेसेन्काइम से तंत्रिका शिखर मेसेन्काइम को अलग करने में कठिनाइयों के कारण अध्ययन करने के लिए चुनौतीपूर्ण हैं। यहाँ, हम प्राथमिक कपाल तंत्रिका शिखर कोशिकाओं की संस्कृति के लिए एक अच्छी तरह से परिभाषित, नियमित प्रोटोकॉल स्थापित करने के लिए बाहर सेट. हमारे दृष्टिकोण में हम प्रारंभिक तंत्रिका शिखर प्रेरण चरण के दौरान माउस तंत्रिका प्लेट सीमा बाहर विच्छेदन. तंत्रिका प्लेट सीमा क्षेत्र explanted और सुसंस्कृत है. तंत्रिका शिखर कोशिकाओं तंत्रिका प्लेट सीमा के आसपास एक उपकला शीट में फार्म, और द्वारा 24 एच explant के बाद, delaminate करने के लिए शुरू, एक उपकला-मेसेन्काइमल संक्रमण (EMT) के दौर से गुजर पूरी तरह से गतिशील तंत्रिका शिखर कोशिकाओं बनने के लिए. हमारे दो आयामी culturing दृष्टिकोण के कारण, अलग ऊतक आबादी (न्यूरल प्लेट बनाम premigratory और प्रवासी तंत्रिका शिखर) आसानी से प्रतिष्ठित किया जा सकता है. लाइव इमेजिंग दृष्टिकोण का उपयोग करना, हम तो तंत्रिका शिखर प्रेरण, EMT और प्रवासी व्यवहार में परिवर्तन की पहचान कर सकते हैं. आनुवंशिक उत्परिवर्ती के साथ इस तकनीक का संयोजन सामान्य और रोग तंत्रिका शिखर कोशिका जीव विज्ञान को समझने के लिए एक बहुत शक्तिशाली दृष्टिकोण होगा.
तंत्रिका शिखर (एनसी) वंश कोशिकाओं की एक क्षणिक, बहुशक्ति और प्रवासी आबादी है जो प्रारंभिक भ्रूण विकास1,2के दौरान विशेष रूप से कशेरुकियों में दिखाई देती है . तंत्रिका शिखर डेरिवेटिव अत्यंत विविध होते हैं, और ग्लिया, चिकनी मांसपेशियों, मेलेनोसाइट्स, न्यूरॉन्स और craniofacial हड्डी और उपास्थि3,4शामिल हैं। क्योंकि तंत्रिका शिखर कई अंग प्रणालियों के समारोह में योगदान देता है, इस वंश मानव भ्रूणजनन के लिए आवश्यक है. Aberrant नेकां विकास सबसे आम मानव जन्म दोष की एक विस्तृत श्रृंखला में फंसा या नहीं है (यानी, फांक होंठ और तालू)5, और भी इस तरह के Hirschsprung रोग (HSCR), वार्डनबर्ग सिंड्रोम (WS), CHARGE सिंड्रोम और विलियम्स सिंड्रोम 6 के रूप में विकारों ,7,8,9.
नेकां विकास Xenopus,लड़की और ज़ेब्राफ़िश मॉडल सहित गैर-मलेरियन मॉडल प्रणालियों की एक संख्या में पता लगाया गया है। स्तनधारियों में, माउस मॉडल में काम तंत्रिका शिखर विकास अंतर्निहित प्रमुख आनुवंशिक घटनाओं में से कुछ की पहचान की है; हालांकि, यह अधिक कठिन हो गया है तंत्रिका शिखर प्रवास की कोशिका जीव विज्ञान का पालन करें, माउस भ्रूण की अगम्यता के कारण (कहीं और10,11की समीक्षा की). इसके अलावा, जबकि लड़की में अध्ययन, Xenopus और ज़ेब्राफ़िश नेकां के लिए एक जीन नियामक नेटवर्क की स्थापना की है, इन पशु मॉडल में समारोह के अध्ययन के नुकसान कभी कभी माउस में एक तुलनीय phenotype प्रदर्शन नहीं करते. उदाहरण के लिए, Xenopuएस, ज़ेब्राफ़िश और लड़की में, गैर-कैनोनिकल Wnt संकेतन सेलुलर तंत्र है कि नेकां अपनी प्रवासी क्षमता प्राप्त करने की अनुमति देता है में से एक है12,13,14,15 . हालांकि, माउस में, गैर-कैनोनिकल Wnt संकेतन की हानि प्रवास16को प्रभावित करने के लिए प्रतीत नहीं होता है। विवो नेकां प्रवास में के रूप में माउस में लंबी अवधि के लिए ट्रैक करने के लिए मुश्किल हो गया है, यह स्पष्ट नहीं है कि क्या इन प्रजातियों मतभेद प्रवास के भिन्न तरीकों को प्रतिबिंबित, या आणविक विनियमन में मतभेद.
के रूप में उल्लेख किया, माउस में नेकां अध्ययन बहुत चुनौतीपूर्ण है क्योंकि भ्रूण के पूर्व utero संस्कृति कठिन है. इसके अलावा, नेकां लगातार मध्यजर्म और न्यूरेक्टोडरम जैसे आसन्न ऊतकों के साथ अंतरंग संपर्क में है। तंत्रिका शिखर-विशिष्ट क्रे ड्राइवरों या exogenous रंगों के हाल ही में उपयोग हमें फ्लोरोसेंट प्रवासी नेकां लेबल करने के लिए अनुमति दी गई है; हालांकि, इन दृष्टिकोण अभी भी सीमित हैं. नेकां प्रवास17,18की कल्पना करने के लिए विभिन्न तकनीकों का वर्णन करने वाली अनेक रिपोर्टों के बावजूद इन तकनीकों को एक सरल और नियमित प्रक्रिया में हल करना कठिन रहा है .
यह स्पष्ट है कि वहाँ तकनीक है कि हैंडलिंग और स्तनधारी नेकां की विशेषता की अनुमति के लिए एक की जरूरत है. हम माउस कपाल नेकां पर हमारे प्रयासों ध्यान केंद्रित के रूप में यह मानव craniofacial विकास और neurocristopathies के अध्ययन के लिए प्राथमिक मॉडल है. हमने नेकां कोशिकाओंकीप्राथमिक संस्कृति का वर्णन करने वाली अनेक रोचक रिपोर्टों के आधार पर अपने दृष्टिकोण को परिष्कृतकिया. यहाँ, हम अच्छी तरह से प्राथमिक नेकां कोशिकाओं explanting के लिए इष्टतम संस्कृति तकनीकों का वर्णन. हम लाइव सेल इमेजिंग विधि और संस्कृति प्लेटों कोट करने के लिए विभिन्न matrices के इष्टतम उपयोग का प्रदर्शन. हमारे प्रोटोकॉल का वर्णन कैसे एक उल्टे माइक्रोस्कोप, जो अन्य माइक्रोस्कोप के साथ उपयोग के लिए एक दिशानिर्देश के रूप में करना है, साथ ही हमारे सेलुलर विश्लेषण का एक विस्तृत सारांश का उपयोग कर रहते नेकां कोशिकाओं के प्रवास पर कब्जा करने के लिए.
एक्सप्लांट से अपेक्षित परिणाम उन कोशिकाओं का एक खूबसूरती से निर्धारित वितरण होना चाहिए जो सूक्ष्मदर्शी के नीचे स्पष्ट रूप से प्रतिष्ठित हैं, जहां एक कोशिकाओं की तीन अलग-अलग आबादी को देख सकता है जो (i) तंत्रिका प्लेट का प्रतिनिधित्व करते हैं, (ii) पूर्वप्रवास, और, (पप) प्रवासी तंत्रिका शिखर कोशिकाओं. हम उपकला-मेसेनकाइमल संक्रमण के दौरान कोशिकाओं की premigratory आबादी की सीमा पर सेल व्यवहार का विश्लेषण करने के लिए कैसे प्रदर्शित करते हैं। हम भी सेल गति, दूरी और कोशिका आकारिकी के लिए पूरी तरह से प्रवासी कोशिकाओं का अध्ययन करने पर हमारे प्रयास ध्यान केंद्रित किया.
स्तनधारी तंत्रिका शिखर कोशिकाओं का अध्ययन स्तनधारी विकास के utero प्रकृति की वजह से वैज्ञानिकों के लिए एक चुनौती रहा है. विवो अध्ययन में स्थापित करने के लिए मुश्किल है, के रूप में भ्रूण शर्तों है कि गर्भाशय में जीवन की नकल के तहत हेरफेर किया जाना चाहिए. व्यवहार में, यह reproducibly संस्कृति इन (E8+) भ्रूण 24 एच से अधिक समय के लिए, विशेष रूप से लाइव इमेजिंग के लिए लगभग असंभव है. इसके अलावा, तंत्रिका शिखर प्रेरण और प्रवास एक साथ तंत्रिका ट्यूब बंद करने और माउस में भ्रूण मोड़ के साथ होते हैं; यह एक महत्वपूर्ण और तनावपूर्ण morphogenetic घटना है, जो अक्सर विफल रहता है जब भ्रूण सुसंस्कृत पूर्व uteroहैं. इस प्रकार, पूर्व utero दृष्टिकोण की सफलता दर आम तौर पर कम है. अमर नेकां कोशिकाओं का उपयोग21 पशु उपयोग को कम करने के लिए एक उपयोगी उपकरण है और यह लंबी अवधि के विश्लेषण, transfection, और संवर्धन अध्ययन के लिए तंत्रिका शिखर कोशिकाओं का एक बेहतर स्रोत प्रदान कर सकते हैं. हालांकि, वहाँ स्पष्ट रूप से मज़बूती से प्राथमिक तंत्रिका शिखर कोशिकाओं संस्कृति की जरूरत है. हमारी विधि माउस नॉक आउट या सशर्त आनुवंशिक मॉडल के लिए लागू है. हमारे लिए एक तुलनीय विधि अन्य तंत्रिका शिखर आबादी20के लिए वर्णित किया गया है ; हालांकि, हमारी विधि अच्छी तरह से murine कपाल नेकां कोशिकाओं के कदम दर कदम अलगाव का वर्णन करता है. हम विभिन्न मैट्रिक्स के उपयोग के साथ-साथ विस्तार से माइग्रेशन विश्लेषण प्रक्रिया का भी वर्णन करते हैं।
लगातार परिणाम प्राप्त करने के लिए, हमने पाया कि भ्रूण के चयन के दौरान मंचन की दिशा में विशेष ध्यान दिया. आश्चर्य नहीं कि सोमियों की संख्या कपाल नेकां के विकास में विभिन्न चरणों से संबंधित है। इसलिए, भ्रूण शरीर रचना विज्ञान का ज्ञान किसी भी प्रयोगात्मक डेटा प्राप्त करने से पहले बहुत महत्वपूर्ण है. इस दृष्टिकोण तो तंत्रिका शिखर कोशिकाओं के असतत आबादी अलग करने की दिशा में अनुकूलित किया जा सकता है, जैविक सवाल और लक्ष्य कोशिकाओं पर निर्भर करता है.
एक बार भ्रूण का चयन किया और विच्छेदन कर रहे हैं, mesodermal कोशिकाओं को आसानी से प्रतिष्ठित किया जा सकता है और बेहतर दृश्य की अनुमति देने के लिए और संदूषण को कम करने के लिए हटाया जाना चाहिए. लंबी अवधि की संस्कृतियों के लिए, तंत्रिका प्लेट ऊतक तंत्रिका ऊतकों द्वारा संदूषण को रोकने के क्रम में चढ़ाना के 24 एच पर हटाया जा सकता है। एक और शोधन फ्लोरोसेंट वंश लेबलिंग का उपयोग हो सकता है (उदाहरण के लिए, एक Wnt1 का उपयोग कर::cre या Sox10::creERT ड्राइवरों फ्लोरोसेंट पत्रकारों के साथ संयुक्त24,25) तंत्रिका शिखर कोशिकाओं से भेद करने के लिए चित्र 2Cमें दर्शाए अनुसार अन्य ऊतक।
पिछली रिपोर्ट विभिन्न matrices पर माउस नेकां explant संस्कृतियों चढ़ाना की क्षमता पर प्रकाश डाला है, सबसे अधिक वाणिज्यिक ECM hydrogels पर, fibronectin और कोलेजन मैं20,21,26. हमारे हाथों में, माउस कपाल नेकां explant संस्कृतियों सफलतापूर्वक सभी तीन matrices पर बड़े हो रहे हैं, मूल रिपोर्ट में निर्दिष्ट सांद्रता पर (डेटा नहीं दिखाया). प्रारंभिक परिष्कृत दृष्टिकोण हम अपने नेकां explant संस्कृतियों के लिए अनुकूलित पसंद के मैट्रिक्स के रूप में एक वाणिज्यिक hydrogel इस्तेमाल किया, जो मुख्य रूप से लेमिन और कोलेजन से मिलकर21(चित्र 3ए-बी). हालांकि, इस hydrogel की संरचना स्पष्ट रूप से परिभाषित नहीं है, अज्ञात विकास कारक और प्रोटीन सामग्री के साथ. जैसे, हम के बाद से फाइब्रोनेक्टिन पर माउस नेकां explant संस्कृतियों चढ़ाना करने के लिए हमारे दृष्टिकोण स्थानांतरित कर दिया है (चित्र 3सी-डी). फाइब्रोनेक्टिन अच्छी तरह से परिभाषित किया गया है और अत्यधिक ईसीएम और तहखाने झिल्ली में व्यक्त किया जाता है जिसके साथ नेकां कोशिकाएं माइग्रेट करती हैंin vivo28,29,30. एक फाइब्रोनेक्टिन मैट्रिक्स का अनुकूलन करने के लिए जो सबसे अच्छा न्यूरल शिखर सेल प्रवास और आकृति विज्ञान को प्रतिरूपक बनाता है जैसा कि हाइड्रोजेल का उपयोग करते हुए देखा गया है, हमने नेकां सेल व्यवहार की तुलना हाइड्रोजेल पर 0.25-30 ग्राम/एमएल फाइब्रोनेक्टिन के लिए किया गया है, और परिभाषित 1 g/ आदर्श गुण प्रदान (डेटा नहीं दिखाया गया). हमें विश्वास है कि इस प्रारंभिक काम में मदद मिल सकती है matrices की व्यवस्थित तुलना के लिए एक रूपरेखा स्थापित, ऐसे fibronectin के रूप में, उन पहले से वर्णित के खिलाफ, अर्थात् कोलेजन और laminin32,33,34. यह विशेष रूप से फाइब्रोनेक्टिन बनाम कोलेजन मैं पर माउस नेकां सेल प्रवासी क्षमता की तुलना करने के लिए दिलचस्प होगा, यह देखते हुए कि कोलेजन-IA1 अंतर्जात माउस, एवियन और मानव नेकां कोशिकाओं द्वारा स्रावित होता है28,30,31,32. कोलेजन मैं इसलिए मैट्रिक्स पसंद के विचार में fibronectin के रूप में के रूप में प्रासंगिक है. यह भी स्वीकार करने योग्य है कि मीडिया में विकास कारकों की जैव उपलब्धता विभिन्न मैट्रिक्स घटकों द्वारा बदला जा सकता है, विशेष रूप से हमारे मीडिया के उच्च सीरम सामग्री दी. इस पर काबू पाने के लिए, हम वर्तमान में सीरम मुक्त परिभाषित संस्कृति की स्थिति का उत्पादन काम कर रहे हैं. इन परिभाषित मीडिया सफलतापूर्वक pluripotent स्टेम सेल क्षेत्र में तंत्रिका शिखर प्रेरण प्रोटोकॉल में उपयोग किया जाता है, लेकिन हमारे नेकां explant संस्कृति प्रणाली के लिए आगे अनुकूलन की आवश्यकता33,34. हमारा काम हृदय और ट्रंक नेकां जैसे अन्य प्रकार की नेकां कोशिकाओं के लिए स्थिति को परिष्कृत करने के लिए और नेकां भेदभाव के बाद के अध्ययनों के लिए भी एक प्रारंभिक बिंदु के रूप में काम कर सकता है। सबसे महत्वपूर्ण बात, इस प्रोटोकॉल अनुप्रयोगों की एक किस्म के लिए कपाल नेकां कोशिकाओं के अलगाव की अनुमति देता है. हम निर्देशित प्रवास, 3-डी प्रवास और आक्रमण पर अध्ययन की कल्पना करते हैं। इस तरीके से अलग कोशिकाओं का इलाज किया जा सकता हैin vitroविश्लेषण के एक नंबर के लिए. उदाहरण के लिए, कोशिकाओं को आसानी से विशिष्ट प्रोटीन को लक्षित करने के लिए विभिन्न छोटे अणुओं का उपयोग कर इलाज किया जा सकता है, वे निर्धारित समय बिंदुओं पर इलाज किया जा सकता है, और washout प्रयोगों सेल व्यवहार की वसूली निर्धारित करने के लिए डिज़ाइन किया जा सकता है (चित्र 4). transfection और भेदभाव परख के लिए लंबी अवधि की संस्कृति संभव है, साथ ही कोशिकाओं के पारित होने (डेटा नहीं दिखाया). तथापि, व्यवहार्यता, सेल नवीकरण और multipotency की क्षमता passaging के बाद मान्य किया जाना चाहिए. ग्लास कवरलिप्स पर चढ़ाया कोशिकाओं को भी लाइव इमेजिंग के बाद, इम्यूनोफ्लोरेसेंट धुंधला प्रोटोकॉल में इस्तेमाल किया जा सकता है। अंत में, इस दृष्टिकोण आनुवंशिक माउस मॉडल से नेकां के प्रवास का अध्ययन करने के लिए एक काफी शक्तिशाली प्रणाली का प्रतिनिधित्व करता है22,23,24,25.
The authors have nothing to disclose.
हम राजा कॉलेज लंदन जैविक सेवा इकाई के लिए आभारी हैं, विशेष रूप से टिफ़नी जार्विस और Lynsey Cashnella उनके निरंतर समर्थन के लिए. हम सलाह और इस प्रोटोकॉल के प्रारंभिक स्थापना के दौरान अभिकर्मकों के साथ मदद के लिए डेरेक Stemple, Mamoru Ishii और रॉबर्ट Maxson धन्यवाद. हम STO कोशिकाओं के गामा विकिरण के साथ मदद के लिए धेराज ताहीम धन्यवाद. हम महान समर्थन के लिए लियू और Krause प्रयोगशालाओं, विशेष रूप से टॉमी Pallett, धन्यवाद. इस कार्य को बीबीएसआरसी (BB/R015953/1 से KJL/MK), एमआरसी डॉक्टरेट प्रशिक्षण कार्यक्रम (एलडी), न्यूलैंड पेडले फंड (एएलएम) और केआरआईपीआईएस द्वितीय, अनुसंधान और प्रौद्योगिकी मंत्रालय (जीएसआरटी), शिक्षा और धार्मिक मंत्रालय से एक छात्र के लिए अनुदान द्वारा वित्त पोषित किया गया था। मामलों, ग्रीस और Fondation सेंट (SGGM करने के लिए).
bFGF | R&D systems | 233-FB | |
b-mercaptoethanol | Gibco | 31350-010 | |
Tissue culture flasks | Corning | 430639 | 25cm2 culture flasks |
DMEM (4500 mg/L glucose) | Sigma | D5671 | |
Dulbecco's phosphate-buffered saline (dPBS) | Sigma | D8537 | |
Ethanol | Fisher Chemicals | E/0650DF/C17 | |
Fetal Bovine Serum | Sigma | TFS AA 10-155 | |
Fetal Bovine Serum (ES Cell FBS) | Gibco | 26140079/16141-079 | |
Fibronectin bovine plasma | Sigma | F1141 | |
Gelatin from bovine skin | Sigma | G9382 | |
L-glutamine | Sigma | G7513 | |
Glass-bottomed, multi-well 24-well tissue culture plate | Ibidi | 82406 | Glass-bottomed, No 1.5, 24-well tissue culture dish with black sides |
Cell migration analysis tool | Ibidi | v2.0 | Manuals for this software can be found at: https://ibidi.com/manual-image-analysis/171-chemotaxis-and-migration-tool.html. |
Circularity Plug-in | ImageJ | v1.29 or later | The circularity plug-in is an extended version of ImageJ/Fiji’s Measure command, designed by Rasband, W., (2000) (wsr@nih.gov). |
LIF | ESGRO by Millipore | ESG1106 | |
Manual Cell Tracking Plug-in | ImageJ | v1.34k or later | ref Cordelieres F. Institut Curie, Orsay (France) 2005 |
Microscope Image Analysis Software | Universal Imaging Corporation | 6.3r7 | MetaMorph Software Series 6.3r7 |
MEM non-essential aminoacids 100X | Gibco | 11140-050 | |
Matrigel (ECM-based Hydrogel) | Corning | 356234 | |
Microscope | Olympus | 1X81 | Olympus 1X81 inverted microscope |
Microscope camera | Photometrics | 512B | Photometrics Cascadell 512B camera (4x UPlanFL N, 10x UPlanFL N, 20x UPlanFL N, 40x UPlanFL N objectives) |
Microscope controller | Olympus | 1X2-UCB | Olympus 1X2-UCB microscope controller |
Microscope temperature controller | Solent Scientific | RS232 | Maintained at 37°C |
Penicillin/streptomycin | Sigma | A5955 | |
Sodium Pyruvate | Sigma | S8636 | |
Statistics software | Graphpad Prism | v7.0 | |
STO feeder cells | ATCC | CRL-1503 | |
Stereomicroscope | Nikon | SMZ | |
XY microscope stage controller | Applied Scientific Instrumentation (ASI) | MS-4400 |