एंटीजेनिक पेप्टाइड और एफसी-III माइमेटिक्स (डीसीएएफ) के दोहरे-फंक्शनल कंजुगेट द्वारा लक्षित एंटीबॉडी ब्लॉकिंग
Summary
एंटीजेनिक पेप्टाइड और एफसी-III माइमेटिक्स (डीसीएएफ) के दोहरे-कार्यात्मक संयुग्मी का विकास हानिकारक एंटीबॉडी के उन्मूलन के लिए उपन्यास है। यहाँ, हम DCAF1 अणु के संश्लेषण के लिए एक विस्तृत प्रोटोकॉल का वर्णन है, जो चुनिंदा 4G2 एंटीबॉडी ब्लॉक कर सकते हैं डेंगू वायरस संक्रमण के दौरान एंटीबॉडी निर्भर वृद्धि प्रभाव को खत्म करने के लिए.
Abstract
जीवों से हानिकारक एंटीबॉडी का उन्मूलन एंटीबॉडी से जुड़े रोगों के हस्तक्षेप के लिए एक मूल्यवान दृष्टिकोण है, जैसे डेंगू रक्तस्रावी बुखार और ऑटोम्यून्यून रोग। के बाद से विभिन्न प्रतीक के साथ एंटीबॉडी के हजारों रक्त में घूम रहे हैं, कोई सार्वभौमिक विधि, एंटीजेनिक पेप्टाइड और एफसी -III mimetics (DCAF) के दोहरे कार्यात्मक संयुग्मी के अलावा, विशिष्ट हानिकारक एंटीबॉडी को लक्षित करने के लिए सूचित किया गया था. DCAF अणुओं के विकास लक्षित चिकित्सा की प्रगति के लिए महत्वपूर्ण योगदान देता है, जो एक डेंगू वायरस (DENV) संक्रमण मॉडल में एंटीबॉडी निर्भर वृद्धि (एडीई) प्रभाव को खत्म करने के लिए प्रदर्शन किया गया और acetylcholine को बढ़ावा देने के लिए एक myasthenia gravis मॉडल में रिसेप्टर गतिविधि. यहाँ, हम एक DCAF अणु के संश्लेषण के लिए एक प्रोटोकॉल का वर्णन (DCAF1), जो चुनिंदा 4G2 एंटीबॉडी को ब्लॉक कर सकते हैं डेंगू वायरस संक्रमण के दौरान ADE प्रभाव क्षीण, और एक ELISA परख द्वारा 4G2 एंटीबॉडी के लिए DCAF1 की बाइंडिंग वर्णन. हमारी विधि में, DCAF1 एक Fc-III पेप्टाइड के एक hydrazine व्युत्पन्न और एक रिकॉमबिनेंट देशी रासायनिक ligation (NCL) के माध्यम से एंटीजेनिक अनुक्रम के साथ लंबे समय से व्यक्त की-हेलिक्स के संयोजन द्वारा संश्लेषित है. इस प्रोटोकॉल सफलतापूर्वक DCAF1 के रूप में के रूप में अच्छी तरह से अन्य DCAF अणुओं के लिए उनके cognate एंटीबॉडी को लक्षित करने के लिए लागू किया गया है.
Introduction
रोगजनक बैक्टीरिया और वायरस1के तटस्थीकरण के लिए हास्य प्रतिरक्षा प्रतिक्रिया में एंटीबॉडीज महत्वपूर्ण भूमिका निभाते हैं . हालांकि, कुछ एंटीबॉडी जीवों के लिए हानिकारक प्रभावों को प्रदर्शित करते हैं, जैसे डीईएवी संक्रमण के दौरान एडीई प्रभाव में क्रॉस-रिएक्टिव एंटीबॉडी और मायस्थेनिया ग्रेविस में अति-सक्रिय एंटीबॉडी, जो एक ऑटोम्यून्यून रोग2,3है। एडीई प्रभाव पार प्रतिक्रियाशील एंटीबॉडी है कि पुल DENV और एफसी रिसेप्टर पेश कोशिकाओं को जोड़ने के लिए बनाने के द्वारा मध्यस्थता है4,5,जबकि myasthenia gravis अत्यधिक एंटीबॉडी है कि acetylcholine रिसेप्टर्स हमले के कारण होता है मांसपेशी ऊतक6,7में सेल-सेल जंक्शनों के बीच। यद्यपि इन रोगों के उपचार के लिए आंशिक रूप से प्रभावी दृष्टिकोण विकसित किए गएहैं ,9,निस्संदेह इन हानिकारक एंटीबॉडी के प्रत्यक्ष उन्मूलन से हस्तक्षेपों के लिए प्रगति होगी .
हाल ही में, DCAF अणुओं, जो दोहरी कार्यात्मक समूहों है लक्षित एंटीबॉडीअवरुद्ध 10के लिए विकसित किया गया है. DCAF एक लंबे पेप्टाइड है कि 3 भागों से बना है: 1) एक प्रतिजन हिस्सा है कि विशिष्ट cognate एंटीबॉडी पहचान कर सकते हैं, 2) एक Fc-III या Fc-III-4C टैग दृढ़ता से एंटीबॉडी के एफसी क्षेत्र के लिए बाध्यकारी के लिए या तो Fc रिसेप्टर या पूरक घटक प्रोटीन को बाधित करने के लिए , 3) एक लंबा – हेलिक लिंकर जो इन दो कार्यात्मक समूहों10को संयुग्मी करता है . Linker हिस्सा, Moesin FERM डोमेन से डिजाइन, Rosseta सॉफ्टवेयर द्वारा अनुकूलित करने के लिए एक DCAF अणु में प्रतिजन हिस्सा और Fc-III हिस्सा एक साथ IgG के फैब और एफसी क्षेत्रों के लिए बाध्य कर सकते हैं सुनिश्चित किया गया था. चार DCAF अणुओं को लक्षित करने के लिए संश्लेषित किया गया है 4 अलग एंटीबॉडी, उनमें से DCAF1 4G2 एंटीबॉडी को खत्म करने के लिए इस्तेमाल किया गया था, जो एक पार प्रतिक्रियाशील एंटीबॉडी DENV संक्रमण के दौरान एडीई प्रभाव में योगदान करने के लिए है; और DACF4 myasthenia gravis10में mab35 एंटीबॉडी अवरुद्ध द्वारा acetylcholine रिसेप्टर्स के बचाव के लिए डिजाइन किया गया था .
वर्तमान अध्ययन में, उदाहरण के रूप में DCAF1 लिया, हम DCAF अणु के संश्लेषण और एक DCAF और उसके cognate एंटीबॉडी के बीच बातचीत का पता लगाने के लिए प्रोटोकॉल दिखाया. DCAF1 एनसीएल दृष्टिकोण11,12 ,13,14, जो एक Fc-III पेप्टाइड और व्यक्त linker-antigen भागों के hydrazine व्युत्पन्न एक साथ conzugates द्वारा अर्द्ध synthesized है. एनसीएल दृष्टिकोण पूरी तरह से रासायनिक संश्लेषण और DCAF1 संश्लेषण के लिए पूरी तरह से पुनः संयोजक अभिव्यक्ति पर महत्वपूर्ण लाभ है, क्योंकि इन तरीकों कम उपज और उच्च लागत के लिए नेतृत्व. वर्तमान दृष्टिकोण न केवल सबसे अधिक लागत प्रभावी तरीका पूर्ण लंबाई DCAF मिल रहा है, लेकिन यह भी linker अपने मूल रूप के रूप में समान भाग की रचना बनाए रख सकते हैं. के बाद से विभिन्न DCAF अणुओं प्रतिजन भागों के अलावा इसी तरह के दृश्यों है, DCAF1 संश्लेषण के लिए हमारे तरीकों और DCAF1 और 4G2 एंटीबॉडी के बीच बातचीत परख अन्य DCAF अणुओं के लिए लागू किया जा सकता है लक्षित ब्लॉक उनके cognate एंटीबॉडी के रूप में अच्छी तरह से.
Protocol
Representative Results
Discussion
यहाँ प्रोटोकॉल एनसीएल प्रकिया, जो चित्र 1में दिखाया गया है का उपयोग करके DCAF1 के अर्द्ध संश्लेषण और पता लगाने का वर्णन करता है। संक्षेप में, DCAF1 के दो टुकड़े रासायनिक संश्लेषित और recombinantly व्यक्त कर…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
इस काम के हिस्से में Tsinghua विश्वविद्यालय-गेट्स फाउंडेशन (नहीं) द्वारा समर्थित किया गया था. OPP1021992), चीन के राष्ट्रीय प्राकृतिक विज्ञान फाउंडेशन (नहीं, 21502103, 21877068 और 041301475), और चीन के राष्ट्रीय कुंजी अनुसंधान और विकास कार्यक्रम (नहीं, 2017YFA0505103).
Materials
| 2-Chlorotrityl resin | Tianjin Nankai HECHENG S&T | ||
| 1-[Bis(dimethylamino)methylene]-1H-1,2,3-triazolo-[4,5-b]pyridinium hexafluorophosphate 3-oxide | GL Biochem | 00703 | |
| 2-(6-Chloro-1H-benzotriazole-1-yl)-1,1,3,3-tetramethylaminiumhexafluorophosphate | GL Biochem | 00706 | |
| 2,2′-Azobis[2-(2-imidazolin-2-yl)propane] dihydrochloride | J&K Scientific | 503236 | |
| 4G2 antibody | Thermo | MA5-24387 | |
| 4-mercaptophenylacetic acid | Alfa Aesar | H27658 | |
| 96-well microtiter plates | NEST | 701001 | |
| Acetonitrile | Thermo-Fisher | A955 | MS Grade |
| AgOAc | Sinopharm Chemical Reagent | 30164324 | |
| anti-GST antibody | Abclonal | AE001 | |
| Anti-mouse IgG, HRP-linked Antibody | Cell Signaling Technology | 7076P2 | |
| BSA | Beijing DINGGUO CHANGSHENG BOITECHNOL | ||
| CD spectrometer | Applied Photophysics Ltd | ||
| dialysis bag | Sbjbio | SBJ132636 | |
| Dichloromethane | Sinopharm Chemical Reagent | 80047360 | |
| diethyl ether | Sinopharm Chemical Reagent | 10009318 | |
| DNA Gel Extraction Kit | Beyotime | D0056 | |
| Fusion Lumos mass spectrometer | Thermo | ||
| GSH Sepharose | GE Lifesciences | ||
| Guanidine hydrochloride | Sinopharm Chemical Reagent | 30095516 | |
| Hydrazine hydrate | Sinopharm Chemical Reagent | 80070418 | |
| Hydrochloric acid | Sinopharm Chemical Reagent | 10011018 | |
| imidazole | SIGMA | 12399-100G | |
| Isopropyl β-D-Thiogalactoside | SIGMA | 5502-5G | |
| kanamycin | Beyotime | ST101 | |
| Methanol | Thermo-Fisher | A456 | MS Grade |
| N, N-Diisopropylethylamine | GL Biochem | 90600 | |
| N, N-Dimethylformamide | Sinopharm Chemical Reagent | 8100771933 | |
| NcoI | Thermo | ER0571 | |
| PBS buffer | Solarbio | P1022 | |
| Peptide BEH C18 Column | Waters | 186003625 | |
| piperidine | Sinopharm Chemical Reagent | 80104216 | |
| Plasmid Extraction Kit | Sangon Biotech | B611253-0002 | |
| QIAexpress Kit | QIAGEN | 32149 | |
| Rapid DNA Ligation Kit | Beyotime | D7002 | |
| Sodium dihydrogen phosphate dihydrate | Sinopharm Chemical Reagent | 20040718 | |
| Sodium hydroxide | Sinopharm Chemical Reagent | 10019762 | |
| Sodium nitrite | Sinopharm Chemical Reagent | 10020018 | |
| sodium chloride | Sinopharm Chemical Reagent | 10019318 | |
| Standard Fmoc-protected amino acids | GL Biochem | ||
| sterilizing pot | Tomy | SX-700 | |
| SUMO Protease | Thermo Fisher | 12588018 | |
| stop solution | Biolegend | 423001 | |
| the whole gene sequence that can express SUMO-linker-antigen | Taihe Biotechnology Compay | ||
| TMB reagent | Biolegend | 421101 | |
| Trifluoroacetic acid | SIGMA | T6508 | |
| Triisopropylsilane | GL Biochem | 91100 | |
| Tris(2-carboxyethyl)phosphine hydrochloride | Aladdin | T107252-5g | |
| tryptone | OXOID | LP0042 | |
| Tween 20 | Solarbio | T8220 | |
| Ultimate 3000 HPLC | Thermo | ||
| vacuum pump | YUHUA | SHZ-95B | |
| XhoI | Thermo | IVGN0086 | |
| yeast extract | OXOID | LP0021 |
References
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