Méthode d'électroporation pour la livraison in vivo de l'ADN de Plasmid dans le Telencephalon adulte de poisson zèbre
Summary
Présenté ici est une méthode d’électroporation pour la livraison d’ADN plasmide et l’étiquetage des cellules épendymogliales dans le téncephalon de poisson zèbre adulte. Ce protocole est une méthode rapide et efficace pour visualiser et tracer les cellules ependymoglial individuelles et ouvre de nouvelles possibilités d’appliquer l’électroporation à un large éventail de manipulations génétiques.
Abstract
L’électroporation est une méthode de transfection dans laquelle un champ électrique est appliqué aux cellules pour créer des pores temporaires dans une membrane cellulaire et augmenter sa perméabilité, permettant ainsi l’introduction de différentes molécules dans la cellule. Dans cet article, l’électroporation est utilisée pour introduire des plasmides aux cellules éparymogliales, qui tapissent la zone ventriculaire du ténaudif zèbre adulte. Une fraction de ces cellules montre des propriétés de cellules souches et génère de nouveaux neurones dans le cerveau du poisson zèbre; par conséquent, l’étude de leur comportement est essentielle pour déterminer leurs rôles dans la neurogenèse et la régénération. L’introduction de plasmides par électroporation permet l’étiquetage à long terme et le suivi d’une seule cellule éparymoglial. En outre, les plasmides tels que Cre recombinase ou Cas9 peuvent être livrés à des cellules éparymogliales uniques, ce qui permet la recombinaison ou l’édition de gènes et offre une occasion unique d’évaluer la fonction génétique autonome de la cellule dans un système contrôlé, naturel l’environnement. Enfin, ce protocole détaillé d’électroporation étape par étape est utilisé pour obtenir l’introduction réussie des plasmides dans un grand nombre de cellules éparymogliales simples.
Introduction
Les poissons zèbres sont d’excellents modèles animaux pour examiner la régénération du cerveau après une blessure au couteau. Par rapport aux mammifères, sur l’échelle évolutive, les espèces moins évoluées telles que le poisson zèbre montrent généralement des taux plus élevés de neurogenèse constitutive et de zones plus larges de résidence de cellules souches neurales adultes, conduisant à la génération constante de nouveaux neurones tout au long la plupart des zones du cerveau dans la vie adulte. Cette caractéristique semble être en corrélation avec la capacité régénératrice significativement plus élevée du poisson zèbre par rapport aux mammifères1, car le poisson zèbre a un potentiel remarquable pour générer efficacement de nouveaux neurones dans la plupart des modèles de lésions cérébrales étudiés2, 3,4,5,6,7,8. Ici, le ténèbre telencephalon est étudié, car il s’agit d’une zone du cerveau avec une neurogenèse proéminente à l’âge adulte. Ces zones de neurogenèse adulte sont homologues aux zones neurogènes dans le cerveau des mammifères adultes9,10,11.
Les zones neurogènes abondantes dans le téencéphale de poisson-zèbre sont présentes en raison de l’existence de gliales radiales comme les cellules ou les cellules d’éparymoglia. Les cellules ependymoglial agissent en tant que cellules souches neurales adultes résidentes et sont responsables de la génération de nouveaux neurones dans le cerveau intact et régénérant3,5. Les expériences de traçage de lignée ont montré que les éparggies ventriculaires réagissent aux blessures, puis prolifèrent et génèrent de nouveaux neuroblastes qui migrent vers le site de lésion5. En raison de la nature everted du téleencéphalon de poisson-zèbre, les cellules ependymoglial tapissent la surface ventriculaire et construisent la paroi ventriculaire ventrale. La paroi ventriculaire dorsal est formée par une couche cellulaire ependymale dorsal (Figure 1A). Fait important, le poisson zèbre ependymoglia incarne les caractéristiques des cellules radiales et des cellules éparymatiques des mammifères. Les longs processus radiaux sont une caractéristique typique des cellules de la gliale radiale, tandis que les extensions cellulaires et les jonctions serrées (ainsi que leurs positions ventriculaires) sont des caractéristiques typiques des cellules éparymales12,13,14. Par conséquent, ces cellules sont appelées cellules éparymoglial.
Pour suivre le comportement in vivo des cellules ependymoglial simples pendant la régénération, elles doivent être étiquetées de manière fiable. Diverses méthodes d’étiquetage cellulaire in vivo pour la microscopie fluorescente ont déjà été décrites, telles que les reporters endogènes ou les colorants lipophiles15. Ces méthodes, contrairement à l’électroporation, peuvent nécessiter de plus longues périodes de temps et souvent n’offrent pas la possibilité d’étiquetage à cellule unique ou de traçage permanent à long terme. L’électroporation, cependant (en plus de l’étiquetage à cellule unique), offre la possibilité d’introduire un nouvel ADN dans la cellule hôte. En outre, par rapport à d’autres méthodes de transfert d’ADN dans les cellules, l’électroporation a été démontrée comme l’une des méthodes les plus efficaces16,17,18,19.
Présenté ici est un protocole d’électroporation qui a été affiné dans le but d’étiqueter les cellules ependymoglial unique dans le ténencéphale de poisson zèbre adulte. Ce protocole permet l’étiquetage des cellules éparymoglial simples afin de les suivre sur une période à long terme20 ou de manipuler des voies spécifiques d’une manière cellulaire-autonome21,22.
Protocol
Representative Results
Discussion
Ce protocole d’électroporation est une méthode in vivo fiable d’étiquetage des cellules ependymoglial individuelles. Le protocole peut avoir besoin d’une autre adaptation pour étiqueter d’autres types de cellules comme les neurones ou les oligodendrocytes. Pour réussir l’étiquetage, des plasmides contenant différents promoteurs peuvent être utilisés. Chicken-bêta actin promoteur, eF1alpha, CMV et ubiquitin promoteur ont déjà été utilisés pour conduire l’expression de différents transgènes dans ependymogl…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Un merci spécial à James Copti pour l’édition du manuscrit. Nous remercions également JN de la Fondation allemande de recherche (DFG) par le SFB 870 et SPP “Integrative Analysis of Olfaction” et SPP 1738 “Emerging roles of non-coding RNAs in nervous system development, plasticity and disease”, SPP1757 ” L’hétérogénéité gliale » et la stratégie d’excellence dans le cadre du Cluster for Systems Neurology de Munich (EXC 2145 SyNergy – ID 390857198).
Materials
| Reagent/Material | |||
| Fast Green | Sigma-Aldrich | F7258-25G | For coloring plasmid solution |
| MS222 | Sigma-Aldrich | A5040-25G | MS222 should be stored at RT (up to two weeks) and protected from light |
| Ultrasound gel | SignaGel, Parker laboratories INC. | 15-60 | Electrode Gel |
| Equipment | |||
| Air pump | TetraTec APS 50, 10l-60l | Can be bought in the pet shops | |
| BTX Tweezertrodes Electrodes | Platinum Tweezertrode, BTX Harvard Apparatus | 45-0486 | 1mm diameter |
| Electroporation device | BTX ECM830 Square Wave Electroporation System, BTX Harvard Apparatus | 45-0662 | |
| Injection device | FemtoJet 4i, Eppendorf | 5252000013 | |
| Standard Wall Borosillicate Glass Capillary | Warner Instruments | 64-0766 | Model No: G100-4 |
| Microloader tips | Eppendorf | 5242956003 | |
| Micro-knife | Fine Science Tools | 10056-12 | |
| Joystick micromanipulator | Narishige Japan | MN – 151 | |
| Needle holder | FemtoJet 4i, Eppendorf | 5252000013 | Needle holder comes together with the injection device |
| Needle pulling device | Narishige Japan | Model No: PC-10 | The PC-10 was discontinued by Narishige in 2017 and replaced by the PC-100 |
| Petri dishes | Greiner Bio-One International | 633161 |
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