組織学的検査と免疫組織化学のための一体的な眼表面組織を得るための無傷の眼球の単離
Summary
このプロトコルは、比較的無傷の位置でまぶた、眼表面、前部および後部セグメントを用いてマウス眼球を単離する方法を説明する。
Abstract
眼表面(OS)は、パルペブラル結膜、バルバル結膜および角膜上皮の3つの接続された部分を有する上皮シートから成っている。OSの破壊は、角膜炎、結膜炎、またはその両方(角膜結膜炎)につながる。特定の遺伝子改変または人工操作を有する実験動物モデルにおいて、OS上皮シートのすべての部分を調べて、各部分の相対病因性変化を並行して評価することが有用である。しかし、OS組織全体の解剖は、主に物理的に分離しながら可動のまぶたと眼球に付貼されたOSの柔らかさと薄さのために困難であった。さらに、硬い頭蓋骨/軌道骨によって形成される深い目のソケットは、手術解剖のための限られたスペースを残して眼球によって完全に占められている。その結果、顔面側から関連するOS組織を伴う眼球の直接解剖は、しばしば組織損傷、特にパルプブラルおよびバルバル結膜につながる。このプロトコルでは、頭蓋骨と眼窩の骨を二分されたマウスヘッドから順番に取り除き、まぶた、眼表面、レンズ、網膜を一つに残す方法を説明した。OSシートの完全性は十分に保存され、単一のセクションで組織学または免疫染色によって調べることができた。
Introduction
眼表面は、パルペブラー結膜、バルバル結膜および角膜1を含む局所的な上皮の連続シートから成っている。多くの腺構造は、眼表面上皮に関連し、一緒に乾燥および環境侵食から角膜表面を保護する涙液膜の層を生成する2.OSの破壊は、角膜炎、結膜炎、またはその両方(角膜結膜炎)につながる。遺伝的要因および環境刺激物またはその相互作用の両方が、OS3,4の病理学的変化に寄与する。したがって、様々な遺伝子操作され、物理的または化学的に誘発された動物モデルが、ヒトOSの疾患プロセスを研究するために使用されてきた。
マウスOSの構造と機能は、多くの点で人間の構造と機能に似ています。眼腺によって分泌される涙液膜成分は、マウスとヒトの間でも類似している。ヒトOS疾患5,6,7のメカニズムを解明するためのマウスモデルを用いて豊富な研究が行われている。多くの場合、同じ実験的処置の下で包括的な情報を得るためには、OSの局所的な分子変化ではなく、グローバルな分析が重要です。したがって、OS の各部分を同時に分析するには、整合性の高いサンプル調製が必要です。
マウスOSは、眼窩/軌道(いくつかの異なる頭蓋骨で作られた骨のカップ)に埋め込まれた眼球と密接に関連し、薄い結合組織を介してそれに接続します。パルペブラーやバルバル結膜を損傷することなく、眼の表面全体を解剖するための途方もない課題があります。これらの課題は、(i)OSが柔らかく薄く、物理的に離動可能なまぶたと眼球に貼り付けられており、ひずみや損傷に対して脆弱です。そして(ii)眼窩骨と眼球の間の限られたスペースは解剖操作を制限する。課題は、大人のマウスのためにはるかに大きいです。胚性マウスでは、眼窩骨の骨化は完全ではなく、周囲の組織は相対的に緩い8である。頭部を除去し、二分し、次にパラホルムアルデヒド(PFA)固定および埋め込み9を直接行うことができる。対照的に、産後および成体マウスの軌道骨は、周囲の組織の厚さで完全に骨化され、固定剤の浸透効率が低下する。さらに、軌道/頭蓋骨の骨は硬く脆く、パラフィンなどの柔らかい埋め込み化合物でそれらを断面すると簡単に壊れます。骨の破片は、近くの組織を満場一致で引き裂き、その結果、劣った組織形態を引き起こす。
多くの公表された研究は、多くの場合、彼らの特定の研究目的のために十分であり得る部分的な眼表面を示しました10,11.文献の総試験は、解剖プロトコル12、13の詳細な説明なしに実証されている全体の無傷の眼表面を示すわずかな研究しか見つかりませんでした。このプロトコルでは、眼球とまぶたと一緒に手つかずの眼表面を残し、物理的な損傷を最小限に抑える、出生後の一体的な眼表面を得るための解剖方法を詳述した。さらにOS組織学を検討し、このプロトコルで調製した組織切片を用いて免疫組織化学を行った。
Protocol
Representative Results
Discussion
無傷の眼球の準備のための1つの重要なリマインダーは、すべての軌道骨、特に小さく、眼窩の底の近くに位置するジュガとラクリマル骨を完全に除去しなければならないということです。残った骨は、その後のヒスロジーを複雑にする可能性があります。小さな骨が誤って解剖から完全に除去されなかった場合には、シャープトウィーザーのペアを使用して埋め込みパラフィンブロックから…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
著者は、原稿の批判的な読み取りのためにロン・ジュ教授に感謝し、すべてのラボメンバーは技術的な援助を受けました。この研究は、中国国立自然科学財団(NSFC:31571077)からの助成金によって支援されました。北京、中国)、広州市科学技術イノベーションプロジェクト(201707020009;広東省広州)、太陽八千大学の「100人プラン」(8300-18821104;広東省広州)、中山眼科研究所の眼科国家キー研究所からの研究資金(303060202400339;広東省広州)。
Materials
| 1× Phosphate buffered saline (PBS) | Transgen Biotech | FG701-01 | |
| 50ml centrifuge tube | Corning | 430829 | |
| Adhesive microscope slides | Various | ||
| Alexa Fluor 488 Phalloidin | Invitrogen/Life Technologies | A12379 | Suggested concentration 1:500 – 1,000 |
| Alexa Fluor 568 Phalloidin | Invitrogen/Life Technologies | A12380 | Suggested concentration 1:500 – 1,000 |
| Anti-K12 antibody | Abcam | ab124975 | Suggested concentration 1:1,000 |
| Anti-K14 antibody | Abcam | ab7800 | Suggested concentration 1:800 |
| Citric acid | Various | ||
| Cover slide | Various | ||
| Curved forceps | World Precision Instruments | 14127 | |
| Dissecting microscope. | Olmpus | SZ61 | |
| Ethyl alcohol | Various | ||
| Fluorescent Microscope | Zeiss | AxioImager.Z2 | |
| Fluoromount-G Mounting media | SouthernBiotech | 0100-01 | |
| Micro dissecting scissors-straight blade | World Precision Instruments | 503242 | |
| Microwave ovens | Galanz | P70D20TL-D4 | |
| Mouse strains | C57/BL6 and Sv129 mixed | ||
| No.4 straight forceps | World Precision Instruments | 501978-6 | |
| Normal Goat Serum | Various | ||
| Paraformaldehyde (PFA) | Various | Prepare a 4% solution in 1× PBS and filter with 0.45μm filter membrane | |
| Tissue culture dish | Various | ||
| Trisodium citrate | Various | ||
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | SLBW6818 |
References
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