プログラマブル出力周波数を備えた自作ボルトアンペメーターを用いてTEER測定を行う簡単なアプローチ
Summary
ここでは、市販の箸電極で使用できるプログラム可能な出力周波数を備えた安価なボルトアンペメーターを設定する方法を示します。
Abstract
経上皮/内皮電気抵抗(TEER)は、1980年代からインビトロバリアモデルシステムの合流性と透過性を決定するために使用されてきました。ほとんどの場合、箸電極は、細胞培養フィルター挿入システムの上下のコンパートメント間の電気インピーダンスを決定するために使用される。フィルター膜は細胞が密着し、偏光し、堅いジャンクションを造ることによって相互作用することを可能にする。この技術は、種々の異なる細胞株(例えば、血液脳関門の細胞、血脳脊髄液関門、または消化管および肺管)で説明されている。TEER測定装置は異なった実験室装置のサプライヤーから容易に得ることができる。しかし、適切なボルタンメーターが自己組み立てされている場合に想像できる、より費用対効果の高いカスタマイズ可能なソリューションがあります。この出版物の全体的な目的は、TEER測定のために市販の箸電極と使用することができるプログラム可能な出力周波数を持つ信頼性の高いデバイスを設定することです。
Introduction
上皮細胞と内皮細胞は細胞境界として機能し、身体の頂点と側側を分離します。それらがタイトな接点を介して接続されている場合、準細胞空間を通る受動物質拡散は1に制限され、選択的に透過性の障壁が形成される。いくつかの人工バリアシステムは、微小血管内皮細胞(HBMEC、血液脳関門3、4、5、6、7)、コロイド叢を用いて2を開発した。上皮細胞(HIBCPP/PCPEC、血脳脊髄液関門8,9,10,11,12,13,14)大腸腺癌細胞(Caco-2、消化器モデル15)、または気道/肺胞細胞株(肺モデル16、17)。これらのシステムは、通常、透過性膜上の単層(すなわち、フィルタ挿入システム)で増殖した細胞から成り立ち、頂点および側側へのアクセスを可能にする。モデル システムの整合性がインビボ条件と一致することが重要です。そこで、細胞層全体のトレーサー化合物の細胞細胞拡散を測定することにより、バリア機能を解析するいくつかの技術が開発されている。これらの物質には、放射性標識されたスクロース、色素ラベルアルブミン、FITCラベル付きイヌリン、または色素標識デクトランス2が含まれる。しかし、化学染料は、さらなる実験のために細胞を使用不能にすることができます。バリアシステムを非侵襲的に監視するために、細胞単層にわたっての経上皮/経体皮電気抵抗(TEER)の測定は、2、18、19を使用することができる。双極電極システムは電極電解質界面での電極偏光インピーダンスの影響を受けるため、四極値測定は一般にこの制限20を克服するために使用される。下敷き技術は、ウィリアム・トムソン(ケルビン卿)21によって1861年に最初に記述された4端子センシング(4T)です。簡単に言えば、電流は一対の電流を運ぶ電極によって注入され、2組の電圧感知電極は電圧降下20を測定するために使用される。今日、いわゆる箸電極は二重電極のペアから成り、それぞれ電圧を測定するための銀/塩化物ペレットと電流2を通過するための銀電極を含む。電気インピーダンスは、頂点と帯状部の間のセル層との間で測定される(図1)。通常12.5Hzの周波数での正方形波信号が外極に適用され、得られた交流電流(AC)が測定されます。さらに、細胞層全体の潜在的な低下は、第2(内部)電極ペアによって測定される。電気インピーダンスはオームの法則に従って計算されます。TEER 値は、インピーダンスとセル層の表面積を乗算することによって正規化され、通常 Ω ∙ cm2として表されます。
セルや電極をより洗練された方法で配置するシステムもありますが、4T測定原理に基づいており、同じ測定装置で使用できます。EndOhmシステムは、例えば、フィルタが挿入される中で、箸電極と同じ構造を有する同心円電極のペアを有するチャンバーおよびキャップを含有する。電極の形状は、膜を横切るより均一な電流密度の流れを可能にし、それによって読み取り値間のばらつきを減らします。さらに複雑な(しかし、より正確な)は、細胞層がリンガーの溶液22で満たされた2つのチャンバーを分離するUssing室である。チャンバ自体は、酸素、CO2、またはN2でガス化し、実験物質を攪拌または補充することができる。細胞層を横切るイオン輸送が起こると、組織の近くにある2つの電圧感知電極によって電位差を測定できます。この電圧は、セル層の隣に配置された2つの電流を運ぶ電極によって取り消されます。測定された電流は、次に正味イオン輸送を与え、バリアの完全性を反映する経上皮抵抗は、22を決定することができる。TEER測定はまたバリアティッシュモデル23、24を表すボディオンチップシステムに適用することができる。これらのシステムは、細胞の生体内条件を模倣し、多くの場合、層の上に積み重ねられたいくつかのタイプの細胞で構成されています。
次のプロトコルでは、市販の測定システムと比較して TEER に統計的に有意な差を生じさせない、プログラマブルな出力周波数を持つ費用対効果の高い信頼性の高いボルタンメーターを設定する方法について説明します。
Protocol
Representative Results
Discussion
自作のボルタンメーターを毎日のルーチンで使用する前に、適切な機能のためにデバイスをチェックすることが不可欠です。我々の場合、40ミリ秒(12.5Hz)の振動の半分の時間がプログラムされましたが、有効振動時間は60ミリ秒(16.7 Hz)であることが判明しました。マイクロコントローラの時間エミッタのこの不正確さは、TEER測定に検出可能な影響を与えなかった。マルチメータのいずれかの周…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
著者らは、ヘルマン・リッジスマイヤーとマーヴィン・ベンデに、電気技術と情報学に関する専門家のアドバイスに感謝したいと思います。
Materials
| 120 kOhm resistor | General (generic) equipment | ||
| Banana plug cables | General (generic) equipment | ||
| Cables | General (generic) equipment | ||
| Chopstick electrode | Merck Millicell | MERSSTX01 | |
| Chopstick electrode (alternative) | WPI World Precision Instruments | STX2 | |
| Crimping tool | General tool | ||
| Digispark / ATtiny85 | AZ-Delivery Vertriebs GmbH | Digispark Rev.3 Kickstarter | |
| DMEM:F12 | Gibco (Thermo Fisher) | 31330038 | |
| Fetal calf serum (FCS)/Fetal Bovine Serum (FBS) | Life Technologies | 10270106 | |
| Filter inserts 3µm translucent | Greiner Bioone | 662631 | |
| HIBCPP | Hiroshi Ishikawa / Horst Schroten | ||
| Insulation stripper | General tool | ||
| Luster terminal | General (generic) equipment | ||
| Oscilloscope | HAMEG | Digital Storage Scope HM 208 | |
| Plotter | PHILIPS | PM 8143 X-Y recorder | |
| Software Arduino | https://www.arduino.cc | Arduino 1.8.9 | |
| Soldering iron | General tool | ||
| Soldering lugs | General (generic) equipment | ||
| Telephone cable with RJ14 (6P4C) connector | General (generic) equipment | ||
| Test resistor | Merck Millicell | MERSSTX04 | |
| True-RMS multimeters | VOLTCRAFT | VC185 | |
| USB charger | General (generic) equipment | ||
| USB extension cord | General (generic) equipment | ||
| Voltohmmeter for TEER measurement | WPI World Precision Instruments | EVOM | |
| Voltohmmeter for TEER measurement (alternative) | Merck Millicell | ERS | |
| Wire end ferrules | General (generic) equipment |
References
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