En enkel tilnærming til å utføre frivillig målinger ved hjelp av en selv laget volt-Amperemeter med programmerbar utgangsfrekvens
Summary
Her demonstrerer vi hvordan man setter opp en billig volt-amperemeter med programmerbare utgangsfrekvens som kan brukes med kommersielt tilgjengelige chopstick elektroder for transepitelial/endothelial elektriske motstandsmålinger.
Abstract
Transepitelial/endothelial elektrisk motstand (frivillig) har vært brukt siden 1980-tallet for å fastslå confluency og permeabilitet av in vitro barriere modellsystemer. I de fleste tilfeller er chopstick elektroder brukes til å bestemme den elektriske impedans mellom øvre og nedre rom i en cellekultur filter sett system som inneholder cellulære monolagere. Filter membranen gjør det mulig for cellene å følge, polariserer og samhandle ved å bygge tette veikryss. Denne teknikken har blitt beskrevet med en rekke forskjellige cellelinjer (f. eks, celler av blod-hjerne-barriere, blod-spinalvæske barriere, eller Gastrointestinal og lunge skrift). FRIVILLIG måle enheter kan lett fås fra ulike laboratorie utstyrsleverandører. Men det er mer kostnadseffektive og tilpassbare løsninger tenkelige hvis en passende voltammeter er selv-montert. Det overordnede målet med denne publikasjonen er å sette opp en pålitelig enhet med programmerbar utgangsfrekvens som kan brukes med kommersielt tilgjengelige chopstick elektroder for frivillig-måling.
Introduction
Epitel og endothelial celler fungerer som cellulære grenser, skille apikale og basolateral sider av kroppen. Hvis de er koblet sammen gjennom tette kryss, passiv substans diffusjon gjennom paracellular mellomrom er begrenset1, noe som resulterer i dannelsen av en selektivt gjennomtrengelig barriere. Flere kunstige barriere systemer har blitt utviklet2 bruker mikrovaskulær endothelial celler (HBMEC, Blood-Brain barriere3,4,5,6,7), akkord plexus epitelceller (HIBCPP/PCPEC, blod-spinalvæske barriere8,9,10,11,12,13,14), tykk adenokarsinom celler (caco-2, gastrointestinale modeller15), eller luftveis/alveolære cellelinjer (lunge modeller16,17). Disse systemene består vanligvis av celler dyrket i en monolag på gjennomtrengelig membraner (dvs. filter sette systemer) for å gi tilgang til apikale og basolateral sider. Det er viktig at integriteten til modell systemet matcher in vivo-forholdene. Derfor har flere teknikker er utviklet for å analysere barrierefunksjon ved å måle paracellular diffusjon av Tracer forbindelser på tvers av celle laget. Disse stoffene inkluderer radiolabeled sukrose, Dye-merket albumin, FITC-merket inulin, eller Dye-merket dextrans2. Kjemiske fargestoffer kan imidlertid gjøre celler ubrukelige for videre eksperimenter. For å overvåke barriere systemer invasivt, måling av transepitelial/transendothelial elektrisk motstand (frivillig) over en mobil monolag kan brukes2,18,19. Fordi bipolar elektrode systemer er påvirket av elektroden polarisering impedans på elektroden-elektrolytt grensesnitt, tetrapolar målinger er vanligvis brukt til å overvinne denne begrensningen20. Den underliggende teknikken er en fire-Terminal sensing (4T) som først ble beskrevet i 1861 av William Thomson (Lord Kelvin)21. I korte trekk er strømmen injisert med et par strømførende elektroder, mens et ekstra par spenningssensor elektroder brukes til å måle spenningsfall20. I dag, såkalte chopstick elektroder består av et par doble elektroder, som hver inneholder en sølv/sølv-klorid pellet for måling av spenning og en sølv elektrode for bestått strøm2. Den elektriske impedans måles mellom apikale og basolateral rommet med celle laget i mellom (figur 1). En firkantbølge signal med en frekvens på typisk 12,5 Hz påføres på de ytre elektrodene og den resulterende vekselstrøm (AC) målt. I tillegg måles den potensielle dråpe over celle laget av det andre (indre) elektrode paret. Elektrisk impedans beregnes deretter i henhold til ohm ‘ s lov. FRIVILLIG verdier er normalisert ved å multiplisere impedans og celle lag overflateareal og er vanligvis uttrykt som Ω ∙ cm2.
Det finnes systemer der celler og elektroder er ordnet på en mer sofistikert måte, men er også basert på 4T måle prinsippet og kan brukes med samme måle enheter. EndOhm-systemer, for eksempel, der filteret er satt inn, inneholder et kammer og lokk med et par konsentriske elektroder med samme struktur som chopstick elektroden. Formen på elektrodene gjør det mulig for en mer ensartet nåværende tetthet flyt over membranen, og dermed redusere variasjon mellom målingene. Enda mer kompleks (men også mer nøyaktig) er en ussing kammer, der et celle lag skiller to kamre fylt med ringer løsning22. Kammeret i seg selv kan være gasset med oksygen, CO2, eller N2, og rørt eller supplert med eksperimentelle stoffer. Som ion transport over celle laget oppstår, en potensiell forskjell kan måles ved to spennings-sensing elektroder nær vevet. Denne spenningen avbrytes av to strømførende elektroder plassert ved siden av celle laget. Den målte strøm vil da gi netto ion transport og transepitelial motstand, noe som reflekterer barriere integritet, kan bestemmes22. Frivillig måling kan også påføres på Body-on-a-chip systemer som representerer barriere-vev modeller23,24. Disse systemene etterligner i vivo forhold i cellene og ofte består av flere typer celler, stablet oppå hverandre i lag.
Følgende protokoll forklarer hvordan du setter opp en kostnadseffektiv og pålitelig voltammeter med programmerbar utgangsfrekvens som produserer ingen statistisk signifikante forskjeller i frivillig sammenlignet med kommersielt tilgjengelige målesystemer.
Protocol
Representative Results
Discussion
Før en selv laget voltammeter kan brukes i en daglig rutine, er det viktig å sjekke enheten for riktig funksjon. I vårt tilfelle var en halv tid for pendling av 40 MS (12,5 Hz) programmert, men den effektive pendling tiden viste seg å være 60 MS (16,7 Hz). Dette unøyaktigheter i microcontroller tid emitter hadde ingen merkbar innvirkning på frivillig målinger. Det kan være best å finne den faktiske frekvensen ved hjelp av frekvensinnstillingen for en av multimetre. Hvis det blir funnet avvik, kan kildekoden jus…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Forfatterne vil gjerne takke Herman Liggesmeyer og Marvin bende for deres faglige råd i electrotechnics og informatikk.
Materials
| 120 kOhm resistor | General (generic) equipment | ||
| Banana plug cables | General (generic) equipment | ||
| Cables | General (generic) equipment | ||
| Chopstick electrode | Merck Millicell | MERSSTX01 | |
| Chopstick electrode (alternative) | WPI World Precision Instruments | STX2 | |
| Crimping tool | General tool | ||
| Digispark / ATtiny85 | AZ-Delivery Vertriebs GmbH | Digispark Rev.3 Kickstarter | |
| DMEM:F12 | Gibco (Thermo Fisher) | 31330038 | |
| Fetal calf serum (FCS)/Fetal Bovine Serum (FBS) | Life Technologies | 10270106 | |
| Filter inserts 3µm translucent | Greiner Bioone | 662631 | |
| HIBCPP | Hiroshi Ishikawa / Horst Schroten | ||
| Insulation stripper | General tool | ||
| Luster terminal | General (generic) equipment | ||
| Oscilloscope | HAMEG | Digital Storage Scope HM 208 | |
| Plotter | PHILIPS | PM 8143 X-Y recorder | |
| Software Arduino | https://www.arduino.cc | Arduino 1.8.9 | |
| Soldering iron | General tool | ||
| Soldering lugs | General (generic) equipment | ||
| Telephone cable with RJ14 (6P4C) connector | General (generic) equipment | ||
| Test resistor | Merck Millicell | MERSSTX04 | |
| True-RMS multimeters | VOLTCRAFT | VC185 | |
| USB charger | General (generic) equipment | ||
| USB extension cord | General (generic) equipment | ||
| Voltohmmeter for TEER measurement | WPI World Precision Instruments | EVOM | |
| Voltohmmeter for TEER measurement (alternative) | Merck Millicell | ERS | |
| Wire end ferrules | General (generic) equipment |
References
- Matter, K., Balda, M. S. Functional analysis of tight junctions. Methods. 30, 228-234 (2003).
- Srinivasan, B., et al. TEER measurement techniques for in vitro barrier model systems. Journal of Laboratory Automation. 20, 107-126 (2015).
- Daniels, B. P., et al. Immortalized human cerebral microvascular endothelial cells maintain the properties of primary cells in an in vitro model of immune migration across the blood brain barrier. Journal of Neuroscience Methods. 212, 173-179 (2013).
- Weksler, B. B., et al. Blood-brain barrier-specific properties of a human adult brain endothelial cell line. Federation of American Societies for Experimental Biology Journal. 19, 1872-1874 (2005).
- Lippmann, E. S., Al-Ahmad, A., Azarin, S. M., Palecek, S. P., Shusta, E. V. A retinoic acid-enhanced, multicellular human blood-brain barrier model derived from stem cell sources. Scientific Reports. 4, 4160 (2014).
- Stins, M. F., Badger, J., Sik Kim, K. Bacterial invasion and transcytosis in transfected human brain microvascular endothelial cells. Microbial Pathogenesis. 30, 19-28 (2001).
- Muruganandam, A., Herx, L. M., Monette, R., Durkin, J. P., Stanimirovic, D. B. Development of immortalized human cerebromicrovascular endothelial cell line as an in vitro model of the human blood-brain barrier. Federation of American Societies for Experimental Biology Journal. 11, 1187-1197 (1997).
- Ishiwata, I., et al. Establishment and characterization of a human malignant choroids plexus papilloma cell line (HIBCPP). Human Cell. 18, 67-72 (2005).
- Dinner, S., et al. A Choroid Plexus Epithelial Cell-based Model of the Human Blood-Cerebrospinal Fluid Barrier to Study Bacterial Infection from the Basolateral Side. Journal of Visualized Experiments. , (2016).
- Schwerk, C., et al. Polar invasion and translocation of Neisseria meningitidis and Streptococcus suis in a novel human model of the blood-cerebrospinal fluid barrier. PLoS One. 7, e30069 (2012).
- Tenenbaum, T., et al. Polar bacterial invasion and translocation of Streptococcus suis across the blood-cerebrospinal fluid barrier in vitro. Cellular Microbiology. 11, 323-336 (2009).
- Gath, U., Hakvoort, A., Wegener, J., Decker, S., Galla, H. J. Porcine choroid plexus cells in culture: expression of polarized phenotype, maintenance of barrier properties and apical secretion of CSF-components. European Journal of Cell Biology. 74, 68-78 (1997).
- Haselbach, M., Wegener, J., Decker, S., Engelbertz, C., Galla, H. J. Porcine Choroid plexus epithelial cells in culture: regulation of barrier properties and transport processes. Microscopy Research and Technique. 52, 137-152 (2001).
- Strazielle, N., Ghersi-Egea, J. F. Physiology of blood-brain interfaces in relation to brain disposition of small compounds and macromolecules. Molecular Pharmaceutics. 10, 1473-1491 (2013).
- Hilgendorf, C., et al. Caco-2 versus Caco-2/HT29-MTX co-cultured cell lines: permeabilities via diffusion, inside- and outside-directed carrier-mediated transport. Journal of Pharmaceutical Sciences. 89, 63-75 (2000).
- Mathia, N. R., et al. Permeability characteristics of calu-3 human bronchial epithelial cells: in vitro-in vivo correlation to predict lung absorption in rats. Journal of Drug Targeting. 10, 31-40 (2002).
- Fuchs, S., et al. Differentiation of human alveolar epithelial cells in primary culture: morphological characterization and synthesis of caveolin-1 and surfactant protein-C. Cell and Tissue Research. 311, 31-45 (2003).
- Furie, M. B., Cramer, E. B., Naprstek, B. L., Silverstein, S. C. Cultured endothelial cell monolayers that restrict the transendothelial passage of macromolecules and electrical current. The Journal of Cell Biology. 98, 1033-1041 (1984).
- Hidalgo, I. J., Raub, T. J., Borchardt, R. T. Characterization of the human colon carcinoma cell line (Caco-2) as a model system for intestinal epithelial permeability. Gastroenterology. 96, 736-749 (1989).
- Yeste, J., et al. Geometric correction factor for transepithelial electrical resistance measurements in Transwell and microfluidic cell cultures. Journal of Physics D Applied Physics. 49 (37), 3754 (2016).
- Northrup, E. VI: The Measurement of Low Resistance. Methods of Measuring Electrical Resistance. , 100-131 (1912).
- Li, H., Sheppard, D. N., Hug, M. J. Transepithelial electrical measurements with the Ussing chamber. Journal of Cystic Fibrosis. 3 (Suppl 2), 123-126 (2004).
- Griep, L. M., et al. BBB on chip: microfluidic platform to mechanically and biochemically modulate blood-brain barrier function. Biomedical Microdevices. 15, 145-150 (2013).
- Esch, M. B., et al. On chip porous polymer membranes for integration of gastrointestinal tract epithelium with microfluidic ‘body-on-a-chip’ devices. Biomedical Microdevices. 14, 895-906 (2012).
- . Arduino Web Editor Available from: https://www.arduino.cc/en/Main/Software (2019)
- Benson, K., Cramer, S., Galla, H. J. Impedance-based cell monitoring: barrier properties and beyond. Fluids and Barriers of the CNS. 10, 5 (2013).
- Hufnagl, M. . Time Resolved Transepithelial Impedance Spectroscopy Of Caco 2 Monolayers Relying on Lithographically Patterned Basolateral Electrode Cell Arrays. , (2010).
- Guimerà, A., Gabriel, G., Parramon, D., Calderón, E., Villa, R., Dössel, O., Schlegel, W. C. Portable 4 Wire Bioimpedance Meter with Bluetooth Link. World Congress on Medical Physics and Biomedical Engineering. International Federation of Medical and Biological Engineering Proceedings. 25/7, (2009).
