Un enfoque simple para realizar mediciones TEER utilizando un antímetro de voltios autohecho con frecuencia de salida programable
Summary
Aquí, demostramos cómo configurar un antímetro de voltios barato con frecuencia de salida programable que se puede utilizar con electrodos de palillo disponibles comercialmente para mediciones de resistencia eléctrica transepitelial/endotelial.
Abstract
La resistencia eléctrica transepitelial/endotelial (TEER) se ha utilizado desde la década de 1980 para determinar la confluencia y permeabilidad de los sistemas de modelos de barrera in vitro. En la mayoría de los casos, los electrodos de palillo se utilizan para determinar la impedancia eléctrica entre el compartimento superior e inferior de un sistema de inserción de filtro de cultivo celular que contiene monocapas celulares. La membrana del filtro permite que las células se adhieran, polaricen e interactúen mediante la construcción de uniones estrechas. Esta técnica se ha descrito con una variedad de diferentes líneas celulares (por ejemplo, células de la barrera hematoencefálica, barrera del líquido hematoencefálico, o tracto gastrointestinal y pulmonar). Los dispositivos de medición TEER se pueden obtener fácilmente de diferentes proveedores de equipos de laboratorio. Sin embargo, hay soluciones más rentables y personalizables imaginables si un voltímetro adecuado se autoensambla. El objetivo general de esta publicación es configurar un dispositivo fiable con frecuencia de salida programable que se pueda utilizar con electrodos de palillo disponibles comercialmente para la medición TEER.
Introduction
Las células epiteliales y endoteliales funcionan como límites celulares, separando los lados apical y basolateral del cuerpo. Si están conectados a través de uniones estrechas, la difusión pasiva de sustancias a través de los espacios paracelulares está restringida1,lo que resulta en la formación de una barrera selectivamente permeable. Se han desarrolladovarios sistemas de barrera artificial 2 utilizando células endoteliales microvasculares (HBMEC, barrera hematoencefálica3,4,5,6,7), plexo coroideo células epiteliales (HIBCPP/PCPEC, barrera de líquido cefalorraquídeo8,9,10,11,12,13,14), Células de adenocarcinoma colorrectal (Caco-2, modelos gastrointestinales15),o líneas de células de las vías respiratorias/alveolares (modelos pulmonares16,17). Estos sistemas suelen consistir en células cultivadas en monocapa sobre membranas permeables (es decir, sistemas de inserción de filtros) para permitir el acceso a los lados apical y basolateral. Es importante que la integridad del sistema modelo coincida con las condiciones in vivo. Por lo tanto, se han desarrollado varias técnicas para analizar la función de barrera midiendo la difusión paracelular de compuestos trazadores a través de la capa celular. Estas sustancias incluyen sacarosa radioetiquetada, albúmina con etiqueta de tinte, inulina etiquetada por FITC o dextrans2con etiqueta de tinte. Sin embargo, los dedos químicos pueden hacer que las células sean inutilizables para más experimentos. Para monitorizar los sistemas de barrera de forma no invasiva, se puede utilizar la medición de la resistencia eléctrica transepitelial/transendotelial (TEER) a través de una monocapa celular2,18,19. Debido a que los sistemas de electrodos bipolares están influenciados por la impedancia de polarización de electrodos en la interfaz electrodo-electrolito, las mediciones tetrapolares se utilizan generalmente para superar esta limitación20. La técnica de subsistencia es una sensación de cuatro terminales (4T) que fue descrita por primera vez en 1861 por William Thomson (Lord Kelvin)21. En resumen, la corriente es inyectada por un par de electrodos portadores de corriente, mientras que un segundo par de electrodos de detección de voltaje se utiliza para medir la caída de tensión20. Hoy en día, los llamados electrodos de palillo consisten en un par de electrodos dobles, cada uno de los cuales contiene un pellet de plata/cloruro de plata para medir la tensión y un electrodo de plata para pasar corriente2. La impedancia eléctrica se mide entre el compartimento apical y el compartimento basolateral con la capa celular en el medio (Figura 1). Una señal de onda cuadrada a una frecuencia de típicamente 12,5 Hz se aplica en los electrodos exteriores y se mide la corriente alterna resultante (AC). Además, la caída potencial a través de la capa celular se mide por el segundo par de electrodos (interno). La impedancia eléctrica se calcula de acuerdo con la ley de Ohm. Los valores de TEER se normalizan multiplicando la impedancia y el área de la superficie de la capa celular y se expresan típicamente como á cm2.
Hay sistemas en los que las células y los electrodos están dispuestos de una manera más sofisticada, pero también se basan en el principio de medición 4T y se pueden utilizar con los mismos dispositivos de medición. Los sistemas EndOhm, por ejemplo, en los que se inserta el filtro, contienen una cámara y una tapa con un par de electrodos concéntricos con la misma estructura que el electrodo de palillo. La forma de los electrodos permite un flujo de densidad de corriente más uniforme a través de la membrana, reduciendo así la variación entre las lecturas. Aún más complejo (pero también más preciso) es una cámara Ussing, donde una capa celular separa dos cámaras llenas con la solución de Ringer22. La cámara en sí puede ser gaseado con oxígeno, CO2,o N2, y agitado o complementado con sustancias experimentales. A medida que se produce el transporte iónico a través de la capa celular, una diferencia potencial se puede medir mediante dos electrodos de detección de voltaje cerca del tejido. Esta tensión se cancela mediante dos electrodos portadores de corriente colocados junto a la capa de celda. La corriente medida dará entonces el transporte iónico neto y la resistencia transepitelial, que refleja la integridad de la barrera, se puede determinar22. La medición TEER también se puede aplicar en sistemas de cuerpo en un chip que representan los modelos de tejido barrera23,24. Estos sistemas imitan las condiciones in vivo de las células y a menudo consisten en varios tipos de células, apiladas una encima de la otra en capas.
El siguiente protocolo explica cómo configurar un voltímetro rentable y fiable con frecuencia de salida programable que no produce diferencias estadísticamente significativas en TEER en comparación con los sistemas de medición disponibles en el mercado.
Protocol
Representative Results
Discussion
Antes de que un voltímetro hecho a sí mismo se pueda utilizar en una rutina diaria, es esencial comprobar el dispositivo para el correcto funcionamiento. En nuestro caso, se programó un medio tiempo de oscilación de 40 ms (12,5 Hz), pero el tiempo de oscilación efectivo resultó ser 60 ms (16,7 Hz). Esta imprecisión del emisor de tiempo del microcontrolador no tuvo ningún impacto detectable en las mediciones TEER. Podría ser mejor determinar la frecuencia real usando el ajuste de frecuencia de uno de los multíme…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Los autores quieren agradecer a Herman Liggesmeyer y Marvin Bende por su asesoramiento experto en electrotecnia e informática.
Materials
| 120 kOhm resistor | General (generic) equipment | ||
| Banana plug cables | General (generic) equipment | ||
| Cables | General (generic) equipment | ||
| Chopstick electrode | Merck Millicell | MERSSTX01 | |
| Chopstick electrode (alternative) | WPI World Precision Instruments | STX2 | |
| Crimping tool | General tool | ||
| Digispark / ATtiny85 | AZ-Delivery Vertriebs GmbH | Digispark Rev.3 Kickstarter | |
| DMEM:F12 | Gibco (Thermo Fisher) | 31330038 | |
| Fetal calf serum (FCS)/Fetal Bovine Serum (FBS) | Life Technologies | 10270106 | |
| Filter inserts 3µm translucent | Greiner Bioone | 662631 | |
| HIBCPP | Hiroshi Ishikawa / Horst Schroten | ||
| Insulation stripper | General tool | ||
| Luster terminal | General (generic) equipment | ||
| Oscilloscope | HAMEG | Digital Storage Scope HM 208 | |
| Plotter | PHILIPS | PM 8143 X-Y recorder | |
| Software Arduino | https://www.arduino.cc | Arduino 1.8.9 | |
| Soldering iron | General tool | ||
| Soldering lugs | General (generic) equipment | ||
| Telephone cable with RJ14 (6P4C) connector | General (generic) equipment | ||
| Test resistor | Merck Millicell | MERSSTX04 | |
| True-RMS multimeters | VOLTCRAFT | VC185 | |
| USB charger | General (generic) equipment | ||
| USB extension cord | General (generic) equipment | ||
| Voltohmmeter for TEER measurement | WPI World Precision Instruments | EVOM | |
| Voltohmmeter for TEER measurement (alternative) | Merck Millicell | ERS | |
| Wire end ferrules | General (generic) equipment |
References
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