Programlanabilir Çıkış Frekansı Ile Kendi Kendine Yapılmış Volt-Ampermetre Kullanarak TEER Ölçümlerini Gerçekleştirmek Için Basit Bir Yaklaşım
Summary
Burada, transepitelyal/endotel elektriksel direnç ölçümleri için piyasada bulunan çubuk elektrotlarla kullanılabilen programlanabilir çıkış frekansına sahip ucuz bir volt-ampermetrenin nasıl kurulabileceğini gösteriyoruz.
Abstract
Transepitelyal/endotel elektriksel direnç (TEER) 1980’lerden beri in vitro bariyer model sistemlerinin birbirliğini ve geçirgenliğini belirlemek için kullanılmaktadır. Çoğu durumda, çubuk elektrotlar hücresel monolayers içeren bir hücre kültürü filtre eklemek sisteminin üst ve alt bölme arasındaki elektrik empedansını belirlemek için kullanılır. Filtre membranı, hücrelerin sıkı kavşaklar oluşturarak yapışmasını, polarize olmasını ve etkileşimde olmasını sağlar. Bu teknik farklı hücre hatları çeşitli ile tarif edilmiştir (örneğin, kan-beyin bariyerhücreleri, kan-beyin-omurilik sıvı bariyeri, veya gastrointestinal ve akciğer yolu). TEER ölçüm cihazları farklı laboratuvar ekipmanları tedarikçilerinden kolayca temin edilebilir. Ancak, uygun bir voltammetre kendi kendine monte edilirse hayal daha uygun maliyetli ve özelleştirilebilir çözümler vardır. Bu yayının genel amacı, TEER ölçümü için ticari olarak kullanılabilen çubuk elektrotlarla kullanılabilecek programlanabilir çıkış frekansına sahip güvenilir bir cihaz kurmaktır.
Introduction
Epitel ve endotel hücreleri hücresel sınırlar olarak işlev, vücudun apikal ve bazolateral taraf ayıran. Eğer sıkı kavşaklar aracılığıyla bağlanırsa, parasellüler alanlardapasif madde difüzyonu sınırlıdır1, seçici geçirgen bir bariyer oluşumu ile sonuçlanan. Çeşitli yapay bariyer sistemleri 2 mikrovasküler endotel hücreleri kullanılarakgeliştirilmiştir (HBMEC, kan-beyin bariyeri3,4,5,6,7), koroid pleksus epitel hücreleri (HIBCPP/PCPEC, kan-beyin-omurilik sıvısıbariyeri 8,9,10,11,12,13,14), kolorektal adenokarsinom hücreleri (Caco-2, gastrointestinal modeller15), veya hava yolu/alveoler hücre hatları (pulmoner modeller16,17). Bu sistemler genellikle geçirgen membranlar üzerinde tek katmanlı olarak yetiştirilen hücrelerden oluşur (yani, filtre ekleme sistemleri) apikal ve bazolateral kenarlara erişim sağlamak için. Model sisteminin bütünlüğünün in vivo koşullarla eşleşmesi önemlidir. Bu nedenle, hücre tabakası boyunca izleyici bileşiklerinin parasellüler difüzyon ölçerek bariyer fonksiyonunu analiz etmek için çeşitli teknikler geliştirilmiştir. Bu maddeler radyoetiketli sakaroz, boya etiketli albumin, FITC etiketli inulin veya boya etiketli dekstrans2içerir. Ancak, kimyasal boyalar hücreleri daha fazla deney için kullanılamaz hale getirebilir. Bariyer sistemlerini noninvaziv olarak izlemek için hücresel monotabaka boyunca transepitelyal/transendolyal elektriksel direnç (TEER) ölçümü2,18,19kullanılabilir. Bipolar elektrot sistemleri elektrot-elektrolit arabirimindeki elektrot polarizasyon empedanstan etkilendiği için, tetrapolar ölçümler genellikle bu sınırlamayı aşmak için kullanılır20. Altatma tekniği ilk William Thomson (Lord Kelvin)21tarafından 1861 yılında açıklanan dört terminalli algılama (4T) olduğunu. Kısacası, akım akım taşıyan elektrotlar bir çift tarafından enjekte edilirken, gerilim ingvesini ölçmek için ikinci bir çift voltaj algılama elektrotları kullanılır20. Günümüzde, sözde çubuk elektrotlar çift elektrotlar bir çift oluşur, her gerilim ölçmek için bir gümüş / gümüş-klorür pelet içeren veakım2 geçmek için gümüş elektrot. Elektriksel empedans, apikal ve bazolateral bölme arasında ölçülür ve hücre tabakası arasındadır (Şekil 1). Dış elektrotlara tipik olarak 12,5 Hz frekansta kare dalga sinyali uygulanır ve ortaya çıkan alternatif akım (AC) ölçülür. Ayrıca, hücre tabakası boyunca potansiyel düşüş ikinci (iç) elektrot çifti ile ölçülür. Elektrikempdansı Daha sonra Ohm yasasına göre hesaplanır. TEER değerleri empedans ve hücre tabakası yüzey alanının çarpılmasıyla normalleşir ve genellikle Ω olarak ifade edilir .
Hücrelerin ve elektrotların daha sofistike bir şekilde düzenlendiği, ancak aynı zamanda 4T ölçüm prensibine dayandığı ve aynı ölçüm cihazlarıyla kullanılabildiği sistemler vardır. Örneğin, filtrenin yerleştirildiği EndOhm sistemleri, çubuk elektrotla aynı yapıya sahip bir çift konsantrik elektrotiçeren bir hazne ve kapak içerir. Elektrotların şekli membran boyunca daha düzgün bir akım yoğunluğu akışı sağlar, böylece okumalar arasındaki değişimi azaltır. Daha da karmaşık (ama aynı zamanda daha doğru) bir Hücre tabakası Ringer çözeltisi22ile dolu iki oda ayırır bir Ussing odası vardır. Oda kendisi oksijen ile gazlı olabilir, CO2, veya N2, ve karıştırılır veya deneysel maddeler ile takviye. Hücre tabakası boyunca iyon taşıması meydana geldiğinde, potansiyel bir fark doku ya da yakın iki voltaj algılama elektrotları ile ölçülebilir. Bu voltaj, hücre tabakasının yanına yerleştirilen iki akım taşıyan elektrot tarafından iptal edilir. Ölçülen akım daha sonra net iyon taşıma ve bariyer bütünlüğünü yansıtan transepitelyal direnç verecek,22belirlenebilir. TEER ölçümü, bariyer doku modellerini temsil eden çip üzerine vücut sistemlerinde de uygulanabilir23,24. Bu sistemler hücrelerin in vivo koşullarını taklit eder ve genellikle katmanlar halinde üst üste yığılmış çeşitli hücre türlerinden oluşur.
Aşağıdaki protokol, teer’de ticari olarak kullanılabilen ölçüm sistemlerine kıyasla istatistiksel olarak anlamlı fark lar üreten programlanabilir çıkış frekansına sahip uygun maliyetli ve güvenilir bir voltammetrenin nasıl kurulabildiğini açıklamaktadır.
Protocol
Representative Results
Discussion
Kendi kendine yapılmış bir voltammetre günlük rutin kullanılabilir önce, uygun işlev için cihaz kontrol etmek esastır. Bizim olgumuzda, 40 ms (12.5 Hz) salınım ın yarı zamanlı olarak programlanmasına karşın, etkili salınım süresi 60 ms (16.7 Hz) olarak ortaya çıktı. Mikrodenetleyicinin zaman yayıcısının bu yanlışlığı TEER ölçümleri üzerinde tespit edilebilir bir etki yaratmaz. Çoklu metrelerden birinin frekans ayarını kullanarak gerçek frekansı belirlemek en iyisi olabilir. Herha…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Yazarlar Elektroteknik ve bilişim konusunda uzman tavsiyeleri için Herman Liggesmeyer ve Marvin Bende teşekkür etmek istiyorum.
Materials
| 120 kOhm resistor | General (generic) equipment | ||
| Banana plug cables | General (generic) equipment | ||
| Cables | General (generic) equipment | ||
| Chopstick electrode | Merck Millicell | MERSSTX01 | |
| Chopstick electrode (alternative) | WPI World Precision Instruments | STX2 | |
| Crimping tool | General tool | ||
| Digispark / ATtiny85 | AZ-Delivery Vertriebs GmbH | Digispark Rev.3 Kickstarter | |
| DMEM:F12 | Gibco (Thermo Fisher) | 31330038 | |
| Fetal calf serum (FCS)/Fetal Bovine Serum (FBS) | Life Technologies | 10270106 | |
| Filter inserts 3µm translucent | Greiner Bioone | 662631 | |
| HIBCPP | Hiroshi Ishikawa / Horst Schroten | ||
| Insulation stripper | General tool | ||
| Luster terminal | General (generic) equipment | ||
| Oscilloscope | HAMEG | Digital Storage Scope HM 208 | |
| Plotter | PHILIPS | PM 8143 X-Y recorder | |
| Software Arduino | https://www.arduino.cc | Arduino 1.8.9 | |
| Soldering iron | General tool | ||
| Soldering lugs | General (generic) equipment | ||
| Telephone cable with RJ14 (6P4C) connector | General (generic) equipment | ||
| Test resistor | Merck Millicell | MERSSTX04 | |
| True-RMS multimeters | VOLTCRAFT | VC185 | |
| USB charger | General (generic) equipment | ||
| USB extension cord | General (generic) equipment | ||
| Voltohmmeter for TEER measurement | WPI World Precision Instruments | EVOM | |
| Voltohmmeter for TEER measurement (alternative) | Merck Millicell | ERS | |
| Wire end ferrules | General (generic) equipment |
References
- Matter, K., Balda, M. S. Functional analysis of tight junctions. Methods. 30, 228-234 (2003).
- Srinivasan, B., et al. TEER measurement techniques for in vitro barrier model systems. Journal of Laboratory Automation. 20, 107-126 (2015).
- Daniels, B. P., et al. Immortalized human cerebral microvascular endothelial cells maintain the properties of primary cells in an in vitro model of immune migration across the blood brain barrier. Journal of Neuroscience Methods. 212, 173-179 (2013).
- Weksler, B. B., et al. Blood-brain barrier-specific properties of a human adult brain endothelial cell line. Federation of American Societies for Experimental Biology Journal. 19, 1872-1874 (2005).
- Lippmann, E. S., Al-Ahmad, A., Azarin, S. M., Palecek, S. P., Shusta, E. V. A retinoic acid-enhanced, multicellular human blood-brain barrier model derived from stem cell sources. Scientific Reports. 4, 4160 (2014).
- Stins, M. F., Badger, J., Sik Kim, K. Bacterial invasion and transcytosis in transfected human brain microvascular endothelial cells. Microbial Pathogenesis. 30, 19-28 (2001).
- Muruganandam, A., Herx, L. M., Monette, R., Durkin, J. P., Stanimirovic, D. B. Development of immortalized human cerebromicrovascular endothelial cell line as an in vitro model of the human blood-brain barrier. Federation of American Societies for Experimental Biology Journal. 11, 1187-1197 (1997).
- Ishiwata, I., et al. Establishment and characterization of a human malignant choroids plexus papilloma cell line (HIBCPP). Human Cell. 18, 67-72 (2005).
- Dinner, S., et al. A Choroid Plexus Epithelial Cell-based Model of the Human Blood-Cerebrospinal Fluid Barrier to Study Bacterial Infection from the Basolateral Side. Journal of Visualized Experiments. , (2016).
- Schwerk, C., et al. Polar invasion and translocation of Neisseria meningitidis and Streptococcus suis in a novel human model of the blood-cerebrospinal fluid barrier. PLoS One. 7, e30069 (2012).
- Tenenbaum, T., et al. Polar bacterial invasion and translocation of Streptococcus suis across the blood-cerebrospinal fluid barrier in vitro. Cellular Microbiology. 11, 323-336 (2009).
- Gath, U., Hakvoort, A., Wegener, J., Decker, S., Galla, H. J. Porcine choroid plexus cells in culture: expression of polarized phenotype, maintenance of barrier properties and apical secretion of CSF-components. European Journal of Cell Biology. 74, 68-78 (1997).
- Haselbach, M., Wegener, J., Decker, S., Engelbertz, C., Galla, H. J. Porcine Choroid plexus epithelial cells in culture: regulation of barrier properties and transport processes. Microscopy Research and Technique. 52, 137-152 (2001).
- Strazielle, N., Ghersi-Egea, J. F. Physiology of blood-brain interfaces in relation to brain disposition of small compounds and macromolecules. Molecular Pharmaceutics. 10, 1473-1491 (2013).
- Hilgendorf, C., et al. Caco-2 versus Caco-2/HT29-MTX co-cultured cell lines: permeabilities via diffusion, inside- and outside-directed carrier-mediated transport. Journal of Pharmaceutical Sciences. 89, 63-75 (2000).
- Mathia, N. R., et al. Permeability characteristics of calu-3 human bronchial epithelial cells: in vitro-in vivo correlation to predict lung absorption in rats. Journal of Drug Targeting. 10, 31-40 (2002).
- Fuchs, S., et al. Differentiation of human alveolar epithelial cells in primary culture: morphological characterization and synthesis of caveolin-1 and surfactant protein-C. Cell and Tissue Research. 311, 31-45 (2003).
- Furie, M. B., Cramer, E. B., Naprstek, B. L., Silverstein, S. C. Cultured endothelial cell monolayers that restrict the transendothelial passage of macromolecules and electrical current. The Journal of Cell Biology. 98, 1033-1041 (1984).
- Hidalgo, I. J., Raub, T. J., Borchardt, R. T. Characterization of the human colon carcinoma cell line (Caco-2) as a model system for intestinal epithelial permeability. Gastroenterology. 96, 736-749 (1989).
- Yeste, J., et al. Geometric correction factor for transepithelial electrical resistance measurements in Transwell and microfluidic cell cultures. Journal of Physics D Applied Physics. 49 (37), 3754 (2016).
- Northrup, E. VI: The Measurement of Low Resistance. Methods of Measuring Electrical Resistance. , 100-131 (1912).
- Li, H., Sheppard, D. N., Hug, M. J. Transepithelial electrical measurements with the Ussing chamber. Journal of Cystic Fibrosis. 3 (Suppl 2), 123-126 (2004).
- Griep, L. M., et al. BBB on chip: microfluidic platform to mechanically and biochemically modulate blood-brain barrier function. Biomedical Microdevices. 15, 145-150 (2013).
- Esch, M. B., et al. On chip porous polymer membranes for integration of gastrointestinal tract epithelium with microfluidic ‘body-on-a-chip’ devices. Biomedical Microdevices. 14, 895-906 (2012).
- . Arduino Web Editor Available from: https://www.arduino.cc/en/Main/Software (2019)
- Benson, K., Cramer, S., Galla, H. J. Impedance-based cell monitoring: barrier properties and beyond. Fluids and Barriers of the CNS. 10, 5 (2013).
- Hufnagl, M. . Time Resolved Transepithelial Impedance Spectroscopy Of Caco 2 Monolayers Relying on Lithographically Patterned Basolateral Electrode Cell Arrays. , (2010).
- Guimerà, A., Gabriel, G., Parramon, D., Calderón, E., Villa, R., Dössel, O., Schlegel, W. C. Portable 4 Wire Bioimpedance Meter with Bluetooth Link. World Congress on Medical Physics and Biomedical Engineering. International Federation of Medical and Biological Engineering Proceedings. 25/7, (2009).
