طريقة عالية الإنتاجية في الموقع لتقدير البليدي النووي الكبدي في الفئران
Summary
نحن نقدم طريقة قوية وفعالة من حيث التكلفة ومرنة لقياس التغيرات في عدد الكبد وploidy النووية داخل عينات الأنسجة الثابتة / cryopreserved التي لا تتطلب قياس خلايا التدفق. نهجنا يوفر توقيع عينة قوية على نطاق واسع من علم خلايا الكبد مثالية لتتبع تطور إصابات الكبد والمرض.
Abstract
عندما يصاب الكبد، تنخفض أعداد خلايا الكبد، في حين أن حجم الخلية وحجمها النووي وزيادة البوليد. التوسع في الخلايا غير parenchymal مثل cholangiocytes، الخلايا العضلية، السلف والخلايا الالتهابية تشير أيضا إلى تلف الكبد المزمن، وإعادة عرض الأنسجة وتطور المرض. في هذا البروتوكول، نصف نهج بسيط عالي الإنتاجية لحساب التغيرات في التركيب الخلوي للكبد المرتبطة بالإصابة والأمراض المزمنة والسرطان. نعرض كيف يمكن استخدام المعلومات المستخرجة من أقسام الأنسجة ثنائية الأبعاد (2D) لقياس ومعايرة البوسيتي النووي الكبدي داخل عينة وتمكين المستخدم من تحديد موقع مجموعات فرعية محددة داخل الكبد في الموقع. تتطلب طريقتنا الوصول إلى مواد الكبد الثابتة /المجمدة، وكواشف الكيمياء المناعية الأساسية وأي منصة تصوير قياسية عالية المحتوى. وهو بمثابة بديل قوي لتقنيات قياس الخلايا القياسية للتدفق ، والتي تتطلب تعطيل الأنسجة التي تم جمعها حديثًا ، وفقدان المعلومات المكانية والتحيز المحتمل للتصنيف.
Introduction
يمكن أن تخضع خلايا الكبد في الكبد الثديي للخلايا المتوقفة لإنتاج خلايا ثنائية النووي ، وتكرار الحمض النووي لإنتاج نواة متعددة البلوية تحتوي على ما يصل إلى محتوى الحمض النووي 16N. زيادة إجمالية الخلوية والنووية في البوليد خلال تطور ما بعد الولادة، والشيخوخة واستجابة للضغوط الخلوية المتنوعة1. عملية تعدد البلح ديناميكية وعكسها2، على الرغم من أن وظيفتها البيولوجية الدقيقة لا تزال غير واضحة3. ويرتبط زيادة ploidy مع انخفاض القدرة التكاثرية4،والتنوع الوراثي2،والتكيف مع الإصابة المزمنة5 وحماية السرطان6. التعديلات بوكريات يبيدي تحدث نتيجة لإيقاع circadianالمعدلة 7, والفوط8. أبرزها, يتم تغيير الملف الجانبي بليفي للكبد من قبل الإصابة والمرض9,وتشير أدلة دامغة إلى أن تغييرات محددة ploidy, مثل زيادة ≥ 8N نواة أو فقدان خلايا الكبد 2N, توفير توقيعات مفيدة لتتبع مرض الكبد الدهني غير الكحولية (NAFLD) تطور3,,10,أو التأثير التفاضلي للعدوى الفيروسية11.
بشكل عام، ترتبط إصابة الكبد وتجديد مع زيادة حجم خلايا الكبد والمنطقة النووية12،جنبا إلى جنب مع انخفاض الأعداد الإجمالية من خلايا الكبد، ولا سيما تلك التي مع محتوى الحمض النووي 2N10،,11. كما أن إصابة Parenchymal في الكبد كثيرا ما يرافقه امكانية توسع الخلايا غير parenchymal (NPCs) ، بما في ذلك الخلايا العضلية سترومال ، والخلايا الالتهابية وخلايا السلف الكبد ية القدرات. طرق عالية الإنتاجية التي توفر لمحة كمية من الخلايا من عدد الخلايا parenchymal وploidy النووية، في حين المحاسبة أيضا للتغيرات في NPCs، وبالتالي لديها إمكانات كبيرة كأدوات بحثية وسريرية لتتبع استجابة الكبد أثناء الإصابة والمرض. مقنعة في الآونة الأخيرة تحليل في الموقع من أطياف ploidy في عينات بشرية من سرطان الكبد الخلوي أيضا تبين أن يتم زيادة كبيرة في البلبيدية النووية داخل الأورام ويتم تضخيمها على وجه التحديد في الأنواع الفرعية للورم أكثر عدوانية مع انخفاض التمايز وفقدان TP5313. وبالتالي، هناك احتمال قوي بأن يساعد التقدم المنهجي في التقييم الكمي للبوليدي النووي في التنميط التكهني لسرطان الكبد في المستقبل.
في هذا البروتوكول ، يتم وصف منهجية مرنة عالية الإنتاجية للتحليل المقارن لأقسام أنسجة كبد الماوس ، والتي توفر التنميط الخلوي التفصيلي لأرقام الخلايا الكبدية ، واستجابة المجلس الوطني للصحافة وطريقة معايرة داخليًا لتقدير ploidy النووي(الشكل 1). وتتميز خلايا الكبد عن الخلايا النووية من قبل عامل الكبد النووي 4 ألفا (HNF4α) وضع العلامات المناعية، قبل توصيف حجم نووي وقياس مورفومات النووية. يتم تقدير “الحد الأدنى من محتوى الحمض النووي” لجميع الأقنعة النووية الدائرية عن طريق دمج كثافة هويشت 33342 (وكيل لكثافة الحمض النووي) مع الحجم النووي ثلاثي الأبعاد (ثلاثي الأبعاد) المُبلغ به. ثم يتم معايرة الحد الأدنى من محتوى الحمض النووي الكبدي باستخدام NPCs لتوليد ملف تعريف ploidy النووية.
يتم إجراء الحصول على الصور والتقسيم النووي وتحليل الصور باستخدام التصوير عالي المحتوى ، مما يتيح فحص مساحات كبيرة من أقسام الكبد ثنائية الأبعاد (2D) التي تحتوي على عشرات الآلاف من الخلايا. يتم توفير برنامج مكتوب خصيصًا للمعالجة الآلية لبيانات تحليل الصور عالية المحتوى لإنتاج ملف تعريف بويدي على نطاق العينة لجميع نواة الكبد الدائرية. يتم تنفيذ هذا باستخدام البرمجيات مجانا لتحميل لحساب ploidy النووية على أساس تحليل الصور ستيريولوجي (SIA)10،11،14،15. وقد تم التحقق من منهجية SIA سابقا عن طريق قياس الخلايا التدفق كطريقة دقيقة، وإن كانت شاقة، لتقدير الكبد النووي ploidy في الكبد14،على افتراض مورفولوجيا نووية دائرية وعلاقة رتيبة بين الحجم النووي ومحتوى الحمض النووي. وفي هذا البروتوكول، تقاس كلا البارامترات النووية بتقييم قياس المورفولوجيا النووية ووضع العلامات على هويشت 33342. ويتبع حساب “الحد الأدنى من محتوى الحمض النووي” لكل قناع نووي معايرة للبوليد النووي الكبدي باستخدام مصادر القدرة النووية، التي لها محتوى معروف للحمض النووي 2-4N وبالتالي فهي بمثابة رقابة داخلية مفيدة.
وبالمقارنة بأساليب قياس الخلايا التقليدية في التدفق16، يتيح النهج الموصوف تقييم البوسيتي النووي الكبدي في الموقع ولا يتطلب الوصول إلى الأنسجة الطازجة أو أساليب التصنيف التي يمكن أن تحيّز النتائج ويصعب توحيدها. وكما هو الحال مع جميع النهج القائمة على المبادرة، فإن الفئات الفرعية النووية الخالية من المواد النووية > 2N ممثلة تمثيلاً ناقصاً بأخذ العينات من الأبعاد الثانية بسبب تقسيم النوى الأكبر خارج المستوى الاستوائي. كما يصف الملف الشخصي على نطاق الأنسجة الحد الأدنى من محتوى الحمض النووي لجميع الأقنعة النووية المنتقلة للكبد، ولا يميز بشكل مباشر بين خلايا الكبد أحادية النووي والخلايا النووية الثنائية التي تحتوي على نويتين منفصلتين (“غير مؤثرة”) من نفس البوسيتي. ومع ذلك، فإن بساطة هذا البروتوكول تسمح بتكييف نطاق كبير لمراعاة بارامترات إضافية مثل التباعد بين النواة أو تحليل محيط الخلايا، من شأنها أن تسهل تحديد الخلايا النووية الثنائية التي توفر تقييمًا أكثر تفصيلاً للخلايا الخلوية.
Protocol
Representative Results
Discussion
يتم وصف نهج عالي المحتوى وعالي الإنتاجية لتحليل إعادة عرض الأنسجة وتقدير البوليد النووي الكبدي في كبد المورين. بمجرد معرفة الإجراء، يمكن للمستخدم معالجة عينات متعددة وصورتها وتحليلها في فترة 3-5 أيام، مما يؤدي إلى إنشاء مجموعات بيانات كبيرة قابلة للاختبار توفر توقيعًا مفصلًا لصحة الكبد. ?…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
تم تمويل هذا العمل من قبل حكومة ماينكو الإسبانية منح BFU2014-58686-P (LAN) وSAF-2017-84708-R (DJB). تم دعم الشبكة المحلية من قبل ماينكو رامون ذ كاخال الوطنية زمالة RYC-2012-11700 وجائزة خطة GenT (Comunitat Valenciana, CDEI-05/20-C), وFMN من قبل الإقليمية ValI +D الطلاب من الجنرالات فالنسيا ACIF/2016/020. ويود البرنامج أن ينوه بالبروفيسور إيوا ك. بالوش على التمويل. نشكر الدكتورة أليسيا مارتينيز روميرو (خدمة قياس الخلايا CIPF) على المساعدة في منصة IN Cell Analyzer.
Materials
| 3,5-diethoxycarboxynl-1,4-dihydrocollidine diet (DDC) | TestDiet | 1810704 | Modified LabDiet mouse diet 5015 with 0.1% DDC |
| Alexa Fluor 488 donkey anti-goat IgG (H+L) | Invitrogen | A11055 | Dilution 1:500 |
| Bovine Serum Albumin | Sigma-Aldrich | A7906 | |
| Cryostat Leica CM1850 UV | Leica biosystems | CM1850 UV | Tissue sectioning |
| Fluorescent Mounting medium | Dako | S3023 | |
| GraphPad Prism | GraphPad Software | Prism 8 | Statistical software for graphing data |
| Hoechst 33342 | Sigma-Aldrich | B2261 | Final concentration 5 µg/mL |
| IN Cell Analyzer 1000 | GE Healthcare Bio-Sciences Corp | High-Content Cellular Imaging and Analysis System | |
| MATLAB | MathWorks | R2019a | Data analytics software for automated analysis of nuclear ploidy |
| Microscope coverslides | VWR International | 630-2864 | Size of 24 x 60 mm |
| Microsoft Office Excel | Microsoft | Speadsheet software | |
| OCT Tissue Tek | Pascual y Furió | 4583 | |
| Paraformaldehyde | Panreac AppliChem | 141451.121 | |
| Pen for immunostaining | Sigma-Aldrich | Z377821-1EA | 5mm tip width |
| Polysine Microscope Slides | VWR International | 631-0107 | |
| Rabbit polyclonal Anti-HNF4α | Thermo Fisher Scientific | PA5-79380 | Dilution 1:250 (alternative) |
| Rabit polyclonal Anti-HNF4α | Santa Cruz Biotechnology | sc-6556 | Dilution 1:200 (antibody used in the study) |
| Tween 20 | Sigma-Aldrich | P5927 |
References
- Gentric, G., Desdouets, C. Polyploidization in liver tissue. American Journal of Pathology. 184 (2), 322-331 (2014).
- Duncan, A. W., et al. The ploidy conveyor of mature hepatocytes as a source of genetic variation. Nature. 467 (7316), 707-710 (2010).
- Gentric, G., Desdouets, C. Liver polyploidy: Dr Jekyll or Mr Hide?. Oncotarget. 6 (11), 8430-8431 (2015).
- Wilkinson, P. D., et al. The Polyploid State Restricts Hepatocyte Proliferation and Liver Regeneration in Mice. Hepatology. 69 (3), 1242-1258 (2019).
- Wilkinson, P. D., et al. Polyploid Hepatocytes Facilitate Adaptation and Regeneration to Chronic Liver Injury. The American Journal of Pathology. 189 (6), 1241-1255 (2019).
- Zhang, S., et al. The Polyploid State Plays a Tumor-Suppressive Role in the Liver. Developmental Cell. 44 (4), 447-459 (2018).
- Chao, H. W., et al. Circadian clock regulates hepatic polyploidy by modulating Mkp1-Erk1/2 signaling pathway. Nature Communications. 8 (1), 2238 (2017).
- Celton-Morizur, S., Merlen, G., Couton, D., Margall-Ducos, G., Desdouets, C. The insulin/Akt pathway controls a specific cell division program that leads to generation of binucleated tetraploid liver cells in rodents. Journal of Clinical Investigation. 119 (7), 1880-1887 (2009).
- Wang, M. J., Chen, F., Lau, J. T. Y., Hu, Y. P. Hepatocyte polyploidization and its association with pathophysiological processes. Cell Death & Disease. 8 (5), e2805 (2017).
- Gentric, G., et al. Oxidative stress promotes pathologic polyploidization in nonalcoholic fatty liver disease. Journal of Clinical Investigation. 125 (3), 981-992 (2015).
- Toyoda, H. Changes to hepatocyte ploidy and binuclearity profiles during human chronic viral hepatitis. Gut. 54 (2), 297-302 (2005).
- Miyaoka, Y., et al. Hypertrophy and Unconventional Cell Division of Hepatocytes Underlie Liver Regeneration. Current Biology. 22 (13), 1166-1175 (2012).
- Bou-Nader, M., et al. Polyploidy spectrum: a new marker in HCC classification. Gut. , (2019).
- Danielsen, H., Lindmo, T., Reith, A. A method for determining ploidy distributions in liver tissue by stereological analysis of nuclear size calibrated by flow cytometric DNA analysis. Cytometry. 7 (5), 475-480 (1986).
- Guidotti, J. E., et al. Liver Cell Polyploidization: A Pivotal Role for Binuclear Hepatocytes. Journal of Biological Chemistry. 278 (21), 19095-19101 (2003).
- Severin, E., Meier, E. M., Willers, R. Flow cytometric analysis of mouse hepatocyte ploidy – I. Preparative and mathematical protocol. Cell and Tissue Research. 238 (3), 643-647 (1984).
- Manzano-Núñez, F., et al. Insulin resistance disrupts epithelial repair and niche-progenitor Fgf signaling during chronic liver injury. PLoS Biology. 17 (1), e2006972 (2019).
- Morales-Navarrete, H., et al. A versatile pipeline for the multi-scale digital reconstruction and quantitative analysis of 3D tissue architecture. eLife. 4, e11214 (2015).
- Baratta, J. L., et al. Cellular organization of normal mouse liver: A histological, quantitative immunocytochemical, and fine structural analysis. Histochemistry and Cell Biology. 131 (6), 713-726 (2009).
- Pandit, S. K., et al. E2F8 is essential for polyploidization in mammalian cells. Nature Cell Biology. 14 (11), 1181-1191 (2012).
- Vinogradov, A. E., Anatskaya, O. V., Kudryavtsev, B. N. Relationship of hepatocyte ploidy levels with body size and growth rate in mammals. Genome. 44 (3), 350-360 (2001).
- Tanami, S., et al. Dynamic zonation of liver polyploidy. Cell and Tissue Research. 368 (2), 405-410 (2017).
- Kudryavtsev, B. N., Kudryavtseva, M. V., Sakuta, G. A., Stein, G. I. Human hepatocyte polyploidization kinetics in the course of life cycle. Virchows Archiv B Cell Pathology Including Molecular Pathology. 64 (1), 387-393 (1993).
- Gentric, G., Celton-Morizur, S., Desdouets, C. Polyploidy and liver proliferation. Clinics and Research in Hepatology and Gastroenterology. 36 (1), 29-34 (2012).
- Uhlén, M., et al. Tissue-based map of the human proteome. Science. 347 (6220), 1260419 (2015).
