Een High-Throughput In Situ Methode voor schatting van Hepatocyte Nucleaire Ploidy in muizen
Summary
We presenteren een robuuste, kosteneffectieve en flexibele methode voor het meten van veranderingen in hepatocyte nummer en nucleaire ploidy binnen vaste / cryopreserved weefsel monsters die geen flow cytometrie vereist. Onze aanpak biedt een krachtige monster-brede handtekening van de lever cytologie ideaal voor het bijhouden van de progressie van leverletsel en ziekte.
Abstract
Wanneer de lever gewond is, hepatocyte nummers afnemen, terwijl de cel grootte, nucleaire grootte en ploidy toenemen. De uitbreiding van niet-parenchymale cellen zoals cholangiocyten, myofibroblasten, voorlopers en ontstekingscellen duidt ook op chronische leverschade, weefselremodellering en ziekteprogressie. In dit protocol beschrijven we een eenvoudige high-throughput benadering voor het berekenen van veranderingen in de cellulaire samenstelling van de lever die worden geassocieerd met letsel, chronische ziekte en kanker. We laten zien hoe informatie uit tweedimensionale (2D) weefselsecties kan worden gebruikt om hepatocyte nucleaire ploidy in een monster te kwantificeren en te kalibreren en de gebruiker in staat te stellen specifieke ploidy-subsets in de lever in situ te lokaliseren. Onze methode vereist toegang tot vast/bevroren levermateriaal, basisimmunocytochemiereagentia en elk standaard high-content imaging platform. Het dient als een krachtig alternatief voor standaard stroomcytometrie technieken, die verstoring van vers verzameld weefsel, verlies van ruimtelijke informatie en potentiële disaggregatie bias vereisen.
Introduction
Hepatocyten in de zoogdierlever kunnen vastgelopen cytokinese ondergaan om binucleaire cellen te produceren, en DNA-endoreplicatie om polyploïde kernen te produceren die maximaal 16N DNA-inhoud bevatten. Totale cellulaire en nucleaire ploidy toename tijdens postnatale ontwikkeling, veroudering en in reactie op diverse cellulaire spanningen1. Het proces van polyploidisatie is dynamisch en omkeerbaar2, hoewel de precieze biologische functie onduidelijk blijft3. Verhoogde ploidy wordt geassocieerd met verminderde proliferative capaciteit4,genetische diversiteit2,aanpassing aan chronische schade5 en bescherming tegen kanker6. Hepatocyte ploidy veranderingen optreden als gevolg van veranderde circadiane ritme7, en spenen8. Het meest in het bijzonder wordt het ploidy-profiel van de lever gewijzigd door letsel en ziekte9, en overtuigend bewijs suggereert dat specifieke ploidieveranderingen, zoals verhoogde ≥8N-kernen of verlies van 2N hepatocyten, nuttige handtekeningen bieden voor het bijhouden van niet-alcoholische leververvetting (NAFLD) progressie3,10, of het differentiële effect van virale infecties11.
In het algemeen worden leverletsel en regeneratie geassocieerd met verhoogde hepatocytecelgrootte en nucleair gebied12, samen met een verminderd totaal aantal hepatocyten, met name die met 2N DNA-gehalte10,11. Parenchymale letsel in de lever gaat ook vaak gepaard met uitbreiding van niet-parenchymale cellen (NPC’s), waaronder stromal myofibroblasten, ontstekingscellen en bipotente leververerstoffen. Methoden met een hoge doorvoer die een kwantitatief cytologisch profiel van parenchymale celnummer en nucleaire ploidie bieden, terwijl ze ook rekening houden met veranderingen in NPC’s, hebben daarom een aanzienlijk potentieel als onderzoek en klinische instrumenten om de respons van de lever tijdens letsel en ziekte te volgen. Overtuigende recente in situ analyse van ploidy spectra in menselijke monsters van hepatocellulair carcinoma tonen ook aan dat nucleaire ploidie is dramatisch verhoogd binnen tumoren en is specifiek versterkt in meer agressieve tumor subtypes met verminderde differentiatie en verlies van TP5313. Daarom is er een grote kans dat methodologische vooruitgang in de kwantitatieve beoordeling van nucleaire ploidy zal helpen bij de toekomst prognostische profilering van leverkanker.
In dit protocol wordt een flexibele high-throughput methodologie beschreven voor de vergelijkende analyse van muisleverweefselsecties, die gedetailleerde cytometrische profilering van hepatocytengetallen, de NPC-respons en een intern gekalibreerde methode voor het schatten van nucleaire ploidie (figuur 1) biedt. Hepatocyten onderscheiden zich van NPC’s door hepatocyte nucleaire factor 4 alpha (HNF4α) immunolabelling, voorafgaand aan de karakterisering van nucleaire grootte en nucleaire morfometrie. “Minimaal DNA-gehalte” wordt geschat voor alle circulaire nucleaire maskers door de integratie van gemiddelde Hoechst 33342 intensiteit (een proxy voor DNA-dichtheid) met geïnterpoleerd driedimensionaal (3D) nucleair volume. Hepatocyte minimale DNA-inhoud wordt vervolgens gekalibreerd met behulp van NPC’s om een nucleaire ploidy profiel te genereren.
Beeldverwerving, nucleaire segmentatie en beeldanalyse worden uitgevoerd met behulp van high-content imaging, waardoor grote gebieden van tweedimensionale (2D) leversecties met tienduizenden cellen kunnen worden gescreend. Een op maat geschreven programma is voorzien voor geautomatiseerde nabewerking van high-content beeldanalyse gegevens om een steekproef-breed ploidy profiel voor alle cirkelvormige hepatocyte kernen te produceren. Dit wordt uitgevoerd met behulp van gratis om software te downloaden om nucleaire ploidy te berekenen op basis van stereologische beeldanalyse (SIA)10,11,14,15. De SIA-methodologie is eerder gevalideerd door flow cytometrie als een nauwkeurige, zij het moeizame, methode voor het schatten van hepatocyte nucleaire ploidy in de lever14, uitgaande van circulaire nucleaire morfologie en een monotoon relatie tussen nucleaire grootte en DNA-inhoud. In dit protocol worden beide nucleaire parameters gemeten door beoordeling van nucleaire morfometrie en Hoechst 33342-etikettering. De berekening van het “minimale DNA-gehalte” voor elk kernmasker wordt gevolgd door kalibratie van hepatocyte nucleaire ploidy met NPC’s, die een bekend 2-4N DNA-gehalte hebben en daarom dienen als een nuttige interne controle.
In vergelijking met conventionele stroomcytometrie methoden16 de beschreven aanpak maakt hepatocyte nucleaire ploidy te worden beoordeeld in situ en vereist geen toegang tot vers weefsel of disaggregatie methoden die kunnen bias resultaten en moeilijk te standaardiseren. Zoals met alle sia-gebaseerde benaderingen, nucleaire ploidy subklassen >2N zijn ondervertegenwoordigd door 2D-bemonstering als gevolg van de doorsnede van grotere kernen buiten het equatoriale vlak. Het weefselbrede ploidy-profiel beschrijft ook het minimale DNA-gehalte voor alle cirkelvormige hepatocytenucleaire maskers, en maakt geen direct onderscheid tussen mononucleaire hepatocyten en binucleaire cellen die twee discrete (“niet-aanrakende” kernen van dezelfde ploidie hebben. De eenvoud van dit protocol biedt echter aanzienlijke mogelijkheden om het aan te passen aan aanvullende parameters, zoals internucleaire afstand of celperimeteranalyse, die de identificatie van binucleaire cellen zouden vergemakkelijken, waardoor een meer gedetailleerde beoordeling van cellulaire ploidie mogelijk is.
Protocol
Representative Results
Discussion
Een high-content, high-throughput benadering voor de analyse van weefsel remodelleren en schatting van hepatocyte nucleaire ploidy in de murine lever wordt beschreven. Eenmaal bekend met de procedure, kan een gebruiker meerdere monsters verwerken, bekijken en analyseren in een periode van 3−5 dagen, waardoor grote testbare gegevenssets worden genereren die een gedetailleerde handtekening van de levergezondheid bieden. Gezien de eenvoud van de monsterbereidingsmethode, samen met de grote aantallen cellen en weefselgebie…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Dit werk werd gefinancierd door de Spaanse MINECO-regering subsidies BFU2014-58686-P (LAN) en SAF-2017-84708-R (DJB). LAN werd ondersteund door een nationale MINECO Ramón y Cajal Fellowship RYC-2012-11700 en Plan GenT award (Comunitat Valenciana, CDEI-05/20-C) en FMN door een regionaal ValI+D studentenschip van de Valenciaanse Generalitat ACIF/2016/020. RP wil prof. Ewa K. Paluch erkennen voor financiering. We danken Dr. Alicia Martínez-Romero (CIPF Cytometry service) voor hulp met het IN Cell Analyzer platform.
Materials
| 3,5-diethoxycarboxynl-1,4-dihydrocollidine diet (DDC) | TestDiet | 1810704 | Modified LabDiet mouse diet 5015 with 0.1% DDC |
| Alexa Fluor 488 donkey anti-goat IgG (H+L) | Invitrogen | A11055 | Dilution 1:500 |
| Bovine Serum Albumin | Sigma-Aldrich | A7906 | |
| Cryostat Leica CM1850 UV | Leica biosystems | CM1850 UV | Tissue sectioning |
| Fluorescent Mounting medium | Dako | S3023 | |
| GraphPad Prism | GraphPad Software | Prism 8 | Statistical software for graphing data |
| Hoechst 33342 | Sigma-Aldrich | B2261 | Final concentration 5 µg/mL |
| IN Cell Analyzer 1000 | GE Healthcare Bio-Sciences Corp | High-Content Cellular Imaging and Analysis System | |
| MATLAB | MathWorks | R2019a | Data analytics software for automated analysis of nuclear ploidy |
| Microscope coverslides | VWR International | 630-2864 | Size of 24 x 60 mm |
| Microsoft Office Excel | Microsoft | Speadsheet software | |
| OCT Tissue Tek | Pascual y Furió | 4583 | |
| Paraformaldehyde | Panreac AppliChem | 141451.121 | |
| Pen for immunostaining | Sigma-Aldrich | Z377821-1EA | 5mm tip width |
| Polysine Microscope Slides | VWR International | 631-0107 | |
| Rabbit polyclonal Anti-HNF4α | Thermo Fisher Scientific | PA5-79380 | Dilution 1:250 (alternative) |
| Rabit polyclonal Anti-HNF4α | Santa Cruz Biotechnology | sc-6556 | Dilution 1:200 (antibody used in the study) |
| Tween 20 | Sigma-Aldrich | P5927 |
References
- Gentric, G., Desdouets, C. Polyploidization in liver tissue. American Journal of Pathology. 184 (2), 322-331 (2014).
- Duncan, A. W., et al. The ploidy conveyor of mature hepatocytes as a source of genetic variation. Nature. 467 (7316), 707-710 (2010).
- Gentric, G., Desdouets, C. Liver polyploidy: Dr Jekyll or Mr Hide?. Oncotarget. 6 (11), 8430-8431 (2015).
- Wilkinson, P. D., et al. The Polyploid State Restricts Hepatocyte Proliferation and Liver Regeneration in Mice. Hepatology. 69 (3), 1242-1258 (2019).
- Wilkinson, P. D., et al. Polyploid Hepatocytes Facilitate Adaptation and Regeneration to Chronic Liver Injury. The American Journal of Pathology. 189 (6), 1241-1255 (2019).
- Zhang, S., et al. The Polyploid State Plays a Tumor-Suppressive Role in the Liver. Developmental Cell. 44 (4), 447-459 (2018).
- Chao, H. W., et al. Circadian clock regulates hepatic polyploidy by modulating Mkp1-Erk1/2 signaling pathway. Nature Communications. 8 (1), 2238 (2017).
- Celton-Morizur, S., Merlen, G., Couton, D., Margall-Ducos, G., Desdouets, C. The insulin/Akt pathway controls a specific cell division program that leads to generation of binucleated tetraploid liver cells in rodents. Journal of Clinical Investigation. 119 (7), 1880-1887 (2009).
- Wang, M. J., Chen, F., Lau, J. T. Y., Hu, Y. P. Hepatocyte polyploidization and its association with pathophysiological processes. Cell Death & Disease. 8 (5), e2805 (2017).
- Gentric, G., et al. Oxidative stress promotes pathologic polyploidization in nonalcoholic fatty liver disease. Journal of Clinical Investigation. 125 (3), 981-992 (2015).
- Toyoda, H. Changes to hepatocyte ploidy and binuclearity profiles during human chronic viral hepatitis. Gut. 54 (2), 297-302 (2005).
- Miyaoka, Y., et al. Hypertrophy and Unconventional Cell Division of Hepatocytes Underlie Liver Regeneration. Current Biology. 22 (13), 1166-1175 (2012).
- Bou-Nader, M., et al. Polyploidy spectrum: a new marker in HCC classification. Gut. , (2019).
- Danielsen, H., Lindmo, T., Reith, A. A method for determining ploidy distributions in liver tissue by stereological analysis of nuclear size calibrated by flow cytometric DNA analysis. Cytometry. 7 (5), 475-480 (1986).
- Guidotti, J. E., et al. Liver Cell Polyploidization: A Pivotal Role for Binuclear Hepatocytes. Journal of Biological Chemistry. 278 (21), 19095-19101 (2003).
- Severin, E., Meier, E. M., Willers, R. Flow cytometric analysis of mouse hepatocyte ploidy – I. Preparative and mathematical protocol. Cell and Tissue Research. 238 (3), 643-647 (1984).
- Manzano-Núñez, F., et al. Insulin resistance disrupts epithelial repair and niche-progenitor Fgf signaling during chronic liver injury. PLoS Biology. 17 (1), e2006972 (2019).
- Morales-Navarrete, H., et al. A versatile pipeline for the multi-scale digital reconstruction and quantitative analysis of 3D tissue architecture. eLife. 4, e11214 (2015).
- Baratta, J. L., et al. Cellular organization of normal mouse liver: A histological, quantitative immunocytochemical, and fine structural analysis. Histochemistry and Cell Biology. 131 (6), 713-726 (2009).
- Pandit, S. K., et al. E2F8 is essential for polyploidization in mammalian cells. Nature Cell Biology. 14 (11), 1181-1191 (2012).
- Vinogradov, A. E., Anatskaya, O. V., Kudryavtsev, B. N. Relationship of hepatocyte ploidy levels with body size and growth rate in mammals. Genome. 44 (3), 350-360 (2001).
- Tanami, S., et al. Dynamic zonation of liver polyploidy. Cell and Tissue Research. 368 (2), 405-410 (2017).
- Kudryavtsev, B. N., Kudryavtseva, M. V., Sakuta, G. A., Stein, G. I. Human hepatocyte polyploidization kinetics in the course of life cycle. Virchows Archiv B Cell Pathology Including Molecular Pathology. 64 (1), 387-393 (1993).
- Gentric, G., Celton-Morizur, S., Desdouets, C. Polyploidy and liver proliferation. Clinics and Research in Hepatology and Gastroenterology. 36 (1), 29-34 (2012).
- Uhlén, M., et al. Tissue-based map of the human proteome. Science. 347 (6220), 1260419 (2015).
