Un metodo ad alto throughput in Situ per la stima della ploidia nucleare epatica nei topi
Summary
Vi presentiamo un metodo robusto, conveniente e flessibile per misurare i cambiamenti nel numero di epatociti e nella ploidia nucleare all’interno di campioni di tessuto fisso/crioconservato che non richiede citometria di flusso. Il nostro approccio fornisce una potente firma a livello campione di citologia epatica ideale per monitorare la progressione delle lesioni epatiche e della malattia.
Abstract
Quando il fegato è ferito, il numero di epatociti diminuisce, mentre le dimensioni della cellula, le dimensioni del nucleare e l’aumento della ploidia. L’espansione di cellule non parenchychymal come cholangiociti, miofibromi, progenitori e cellule infiammatorie indicano anche danni epatici cronici, rimodellamento dei tessuti e progressione della malattia. In questo protocollo, descriviamo un semplice approccio ad alto contenuto di velocità per calcolare i cambiamenti nella composizione cellulare del fegato che sono associati a lesioni, malattie croniche e cancro. Mostriamo come le informazioni estratte dalle sezioni di tessuto bidimensionali (2D) possono essere utilizzate per quantificare e calibrare la ploidia nucleare degli epatociti all’interno di un campione e consentire all’utente di individuare specifici sottoinsiemi di ploidia all’interno del fegato in situ. Il nostro metodo richiede l’accesso a materiale epatico fisso/congelato, reagenti di immunocitochimica di base e qualsiasi piattaforma di imaging standard ad alto contenuto. Serve come una potente alternativa alle tecniche di citometria di flusso standard, che richiedono l’interruzione del tessuto appena raccolto, la perdita di informazioni spaziali e potenziale pregiudizio di disaggregazione.
Introduction
Gli epatociti nel fegato dei mammiferi possono sottoporsi a citocinesi bloccata per produrre cellule binucleari, e l’endoreplicare del DNA per produrre nuclei poliploidi contenenti fino a 16N contenuto di DNA. Aumento complessivo della ploidia cellulare e nucleare durante lo sviluppo postnatale, l’invecchiamento e in risposta a diversi stress cellulari1. Il processo di poliploidizzazione è dinamico e reversibile2, anche se la sua precisa funzione biologica rimane poco chiara3. L’aumento della ploidia è associato alla ridotta capacità proliferiva4,alla diversità genetica2,all’adattamento alle lesioni croniche5 e alla protezione del cancro6. Le alterazioni della ploidia epatocita si verificano a seguito del ritmo circadiano alterato7e dello svezzamento8. In particolare, il profilo ploidiario del fegato è alterato da lesioni e malattia9, e prove convincenti suggeriscono che cambiamenti specifici ploidiari, come aumento dei nuclei di 8N dollari o perdita di 2N epatociti, forniscono firme utili per monitorare la progressione della malattia grassa non alcolica (NAFLD)3,10, o l’impatto differenziale delle infezioni virali11.
In termini generali, le lesioni e la rigenerazione del fegato sono associate all’aumento delle dimensioni delle cellule epatociti e dell’area nucleare12,insieme alla riduzione del numero complessivo di epatociti, in particolare quelli con 2N contenuto di DNA10,11. La lesione parenchimale nel fegato è spesso accompagnata anche dall’espansione di cellule non parenchymal (NPC), tra cui miofibromi stromali, cellule infiammatorie e cellule progenitrici epatiche bipotenti. I metodi ad alto contenuto di velocità di sviluppo che forniscono un profilo citologico quantitativo del numero di cellule parenchiche e della ploidia nucleare, pur tenendo conto dei cambiamenti nei PNG, hanno quindi un notevole potenziale come ricerca e strumenti clinici per monitorare la risposta del fegato durante lesioni e malattie. Icodraggi recenti analisi in situ degli spettri ploidi in campioni umani di carcinoma epatocellulare dimostrano anche che la ploidia nucleare è drammaticamente aumentata all’interno dei tumori ed è specificamente amplificata in sottotipi tumorali più aggressivi con ridotta differenziazione e perdita di TP5313. Pertanto, vi è una forte possibilità che i progressi metodologici nella valutazione quantitativa della ploidia nucleare contribuiscano alla profilazione prognostica futura del cancro del fegato.
In questo protocollo, viene descritta una metodologia flessibile ad alto rendimento per l’analisi comparativa delle sezioni del tessuto epatico del topo, che fornisce una profilazione citometrica dettagliata dei numeri di epatociti, la risposta NPC e un metodo calibrato internamente per la stima della ploidia nucleare (Figura 1). Gli epatociti si distinguono dai PNG per immunoetichettazione del fattore nucleare 4 alfa (HNF4) del fattore nucleare dell’epatocite, prima della caratterizzazione delle dimensioni nucleari e della morfometria nucleare. Il “contenuto minimo di DNA” è stimato per tutte le maschere nucleari circolari integrando l’intensità media di Hoechst 33342 (un proxy per la densità del DNA) con volume nucleare tridimensionale interpolato (3D). Il contenuto minimo di DNA di Epatocite viene quindi calibrato utilizzando i PNG per generare un profilo di ploidia nucleare.
L’acquisizione di immagini, la segmentazione nucleare e l’analisi delle immagini vengono eseguite utilizzando l’imaging ad alto contenuto, consentendo la screening di ampie aree di sezioni epatiche bidimensionali (2D) contenenti decine di migliaia di cellule. Viene fornito un programma scritto su misura per la post-elaborazione automatica di dati di analisi delle immagini ad alto contenuto per produrre un profilo di ploidia a livello di campione per tutti i nuclei circolari di epatociti. Questa operazione viene eseguita utilizzando software gratuito per scaricare per calcolare la ploidia nucleare basata sull’analisi stereologica delle immagini (SIA)10,11,14,15. La metodologia SIA è stata precedentemente convalidata dalla citometria di flusso come un metodo accurato, anche se laborioso, per stimare la ploidia nucleare epatocitica nel fegato14, assumendo una morfologia nucleare circolare e una relazione monotonica tra dimensione nucleare e contenuto di DNA. In questo protocollo, entrambi i parametri nucleari sono misurati mediante valutazione della morfometria nucleare e dell’etichettatura Hoechst 33342. Il calcolo del “contenuto minimo di DNA” per ogni maschera nucleare è seguito dalla calibrazione della ploidia nucleare epatocite utilizzando NPC, che hanno un noto 2-4N contenuto di DNA e quindi servono come un utile controllo interno.
Rispetto ai metodi convenzionali di citometria di flusso16, l’approccio descritto consente di valutare la ploidia nucleare epatocite in situ e non richiede l’accesso a tessuti nuovi o metodi di disaggregazione che possono biasizzare i risultati ed essere difficili da standardizzare. Come per tutti gli approcci basati su SIA, le sottoclassi di ploidia nucleare >2N sono sottorappresentate dal campionamento 2D a causa della sezionamento di nuclei più grandi al di fuori del piano equatoriale. Il profilo ploidiario a livello di tessuto descrive anche il contenuto minimo di DNA per tutte le maschere nucleari circolari degli epatociti e non discrimina direttamente tra epatociti mononucleari e cellule binucleari che hanno due nuclei discreti (“non toccanti”) dello stesso ploidio. Tuttavia, la semplicità di questo protocollo consente di adattare in modo considerevole per tenere conto di parametri aggiuntivi come la spaziatura internucleare o l’analisi del perimetro cellulare, che faciliterebbero l’identificazione delle cellule binucleari fornendo una valutazione più dettagliata della ploidia cellulare.
Protocol
Representative Results
Discussion
Viene descritto un approccio ad alto contenuto e ad alto contenuto per l’analisi del rimodellamento dei tessuti e la stima della ploidia nucleare epatocite nel fegato murino. Una volta che ha familiarità con la procedura, un utente può elaborare, immagini e analizzare più campioni in un periodo di 3-5 giorni, generando set di dati testati di grandi dimensioni che forniscono una firma dettagliata dello stato di salute del fegato. Data la semplicità del metodo di preparazione del campione, insieme al gran numero di cel…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Questo lavoro è stato finanziato dalla sovvenzione spagnola del governo MINECO BFU2014-58686-P (LAN) e SAF-2017-84708-R (DJB). LAN è stata sostenuta da un premio nazionale DI MineCO Ramàn y Cajal Fellowship RYC-2012-11700 e Plan GenT (Comunitat Valenciana, CDEI-05/20-C) e FMN da una studentessa regionale della Generalitat Valencian ACIF/2016/020. RP vorrebbe riconoscere il professor Ewa K. Paluch per il finanziamento. Ringraziamo la Dott.ssa Alicia Martanez-Romero (servizio CIPF Cytometry) per l’aiuto con la piattaforma IN Cell Analyzer.
Materials
| 3,5-diethoxycarboxynl-1,4-dihydrocollidine diet (DDC) | TestDiet | 1810704 | Modified LabDiet mouse diet 5015 with 0.1% DDC |
| Alexa Fluor 488 donkey anti-goat IgG (H+L) | Invitrogen | A11055 | Dilution 1:500 |
| Bovine Serum Albumin | Sigma-Aldrich | A7906 | |
| Cryostat Leica CM1850 UV | Leica biosystems | CM1850 UV | Tissue sectioning |
| Fluorescent Mounting medium | Dako | S3023 | |
| GraphPad Prism | GraphPad Software | Prism 8 | Statistical software for graphing data |
| Hoechst 33342 | Sigma-Aldrich | B2261 | Final concentration 5 µg/mL |
| IN Cell Analyzer 1000 | GE Healthcare Bio-Sciences Corp | High-Content Cellular Imaging and Analysis System | |
| MATLAB | MathWorks | R2019a | Data analytics software for automated analysis of nuclear ploidy |
| Microscope coverslides | VWR International | 630-2864 | Size of 24 x 60 mm |
| Microsoft Office Excel | Microsoft | Speadsheet software | |
| OCT Tissue Tek | Pascual y Furió | 4583 | |
| Paraformaldehyde | Panreac AppliChem | 141451.121 | |
| Pen for immunostaining | Sigma-Aldrich | Z377821-1EA | 5mm tip width |
| Polysine Microscope Slides | VWR International | 631-0107 | |
| Rabbit polyclonal Anti-HNF4α | Thermo Fisher Scientific | PA5-79380 | Dilution 1:250 (alternative) |
| Rabit polyclonal Anti-HNF4α | Santa Cruz Biotechnology | sc-6556 | Dilution 1:200 (antibody used in the study) |
| Tween 20 | Sigma-Aldrich | P5927 |
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