マウスにおける肝細胞核プロイドの推定に対するSitu法におけるハイスループット
Summary
フローサイトメトリーを必要としない固定/凍結保存組織サンプル内で、肝細胞数および核プロイドの変化を測定するための堅牢で費用対効果の高い柔軟な方法を提示します。私たちのアプローチは、肝臓の損傷や病気の進行を追跡するのに理想的な肝臓細胞学の強力なサンプル全体の署名を提供します。
Abstract
肝臓が損傷すると、肝細胞数が減少し、細胞サイズ、核サイズ、策略が増加する。また、コリンギオサイト、筋線維芽細胞、前駆細胞、炎症細胞などの非実質細胞の拡張は、慢性肝障害、組織改変および疾患進行を示す。このプロトコルでは、傷害、慢性疾患および癌に関連する肝臓の細胞組成の変化を計算するための単純なハイスループットアプローチを説明する。我々は、2次元(2D)組織切片から抽出された情報を使用して、サンプル内の肝細胞核策略を定量化および較正し、ユーザーが肝臓内の特定のプロイドサブセットをその場で見つけることができる方法を示す。我々の方法は、固定/凍結された肝臓材料、基本的な免疫細胞化学試薬および任意の標準的な高含有画像化プラットフォームへのアクセスを必要とする。これは、新たに収集された組織の破壊、空間情報の損失および潜在的な崩壊バイアスを必要とする標準的なフローサイトメトリー技術に代わる強力な代替手段として機能します。
Introduction
哺乳類の肝臓の肝細胞は、双核細胞を産生するために失速したサイトカネシスを受け、DNA内在性を有して最大16NのDNA含量を含む多倍核を産生する。出生後の発達、老化、および多様な細胞ストレスへの応答における全体的な細胞および核の策略の増加1.多重化のプロセスは動的かつ可逆的である2、その正確な生物学的機能は不明のままであるが 3.増加したプロイディは、増殖能力の低下に関連付けられている 4 、 遺伝的多様性2、 慢性傷害5および癌保護への適応6.肝細胞の策略変化は、概日リズム7の変化の結果として起こり、8を引き上げ、最も顕著なのは、肝臓のプロイドプロファイルが傷害および疾患9によって変化し、そして説得力のある証拠は、≥8N核の増加または2N肝細胞の喪失などの特定の策略変化が、非アルコール性脂肪性肝疾患(NAFLD)進行3、10、10またはウイルス感染の3差有差影響を追跡するための有用な署名を提供することを示唆している。
一般に、肝損傷および再生は、肝細胞サイズの増加および核領域12に関連しており、肝細胞の全体数が減少すると共に、特に2NDNA含量10、11,11を有するものである。肝臓における実質損傷はまた、多くの場合、間質筋線維芽細胞、炎症性細胞およびバイポテンシー肝前駆細胞を含む非実質細胞(NPC)の拡張を伴う。パンキマル細胞数と核策略の定量的細胞学的プロファイルを提供する高スループット法は、NPCの変化を考慮しながら、傷害および疾患時の肝臓の応答を追跡する研究および臨床ツールとしてかなりの可能性を秘めています。肝細胞癌のヒトサンプルにおけるプロイドスペクトルの最新の説得力のある分析は、核プロイドが腫瘍内で劇的に増加し、TP5313の分化および損失を伴うより積極的な腫瘍サブタイプにおいて特異的に増幅されることを示している。したがって、核策略の定量的評価における方法論的進歩が、肝臓癌の将来の予後プロファイリングに役立つ可能性が高い。
本プロトコルでは、マウス肝組織切片の比較分析のための柔軟なハイスループット方法論が記載されており、これは肝細胞数の詳細な細胞量プロファイリング、NPC応答および核プロイドを推定するための内部的に較正された方法を提供する(図1)。肝細胞は、核サイズおよび核施設の特性評価に先立って、肝細胞核因子4α(HNF4α)免疫標識によってNPCと区別される。平均Hoechst 33342強度(DNA密度のプロキシ)と補間された3次元(3D)核体積を統合することによって、すべての円形核マスクに対して「最小DNA含有量」が推定される。その後、最小DNA含有量を測定し、NPCを使用して評価し、核プロイドプロファイルを生成します。
画像取得、核セグメンテーション、画像解析は高内容イメージングを用いて行われ、数万個の細胞を含む2次元(2D)肝臓切片の広い領域をスクリーニングすることが可能です。カスタム作成プログラムは、すべての円形肝細胞核のサンプル全体のプロイドプロファイルを生成するために、高コンテンツ画像解析データの自動後処理のために提供されます。これは、自由にソフトウェアをダウンロードして、立体画像解析(SIA)10、11、14、15に基づいて核策略10,11,14を15計算するために実行されます。SIAの方法論は、循環核形態と核サイズとDNA含有量の単調な関係を仮定して、肝臓14における肝細胞核策略を推定するための正確で、骨の折れる方法としてフローサイトメトリーによって以前に検証されてきた。この議定書では、両方の核パラメータは、核施設とHoechst 33342ラベリングの評価によって測定される。各核マスクの「最小DNA含有量」の計算に続いて、既知の2-4N DNA含有量を有するNPCを用いた肝細胞核プロイドの較正が行われ、有用な内部制御として機能する。
従来のフローサイトメトリー法16と比較して、説明したアプローチは、肝細胞核プロイドをその際に評価することを可能にし、結果を偏らさせ得る新鮮な組織または分解方法へのアクセスを必要とせず、標準化することが困難である。すべての SIA ベースのアプローチと同様に、核の小数部 >2N は、赤道平面の外側の大きな核の断面化により、2D サンプリングによって過小評価されます。組織全体の策略プロファイルはまた、すべての円形肝細胞核マスクの最小DNA含有量を記述し、同じ策略の2つの離散(「非接触」)核を有する単核肝細胞と双核細胞を直接区別しない。しかし、このプロトコルの単純さは、細胞の策略のより詳細な評価を提供する双核細胞の同定を容易にする核間間隔または細胞周囲分析などの追加パラメータを考慮するように適応するためのかなりの範囲を可能にする。
Protocol
Representative Results
Discussion
マウス肝臓における肝細胞核プロイドの組織改修および推定の解析のための高含有、ハイスループットアプローチが記載されている。この手順に慣れると、ユーザーは3〜5日間で複数のサンプルを処理、画像化、分析し、肝臓の健康の詳細な署名を提供する大規模なテスト可能なデータセットを生成できます。サンプル調製方法のシンプルさを考えると、多数の細胞と組織領域が分析され(平?…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
この作業は、スペインのMINECO政府がBFU2014-58686-P(LAN)とSAF-2017-84708-R(DJB)を付与することによって資金提供されました。LANは、全国のミネコ・ラモン・イ・カハル・フェローシップRYC-2012-11700とプランGenT賞(コンニタット・バレンシアナ、CDEI-05/20-C)、およびバレンシア・ジェネラリタットACIF/2016/020の地域ValI +D学生シップによってFMNによって支えられました。RPは、エワ・K・パルチ教授の資金調達を認めたいと考えています。INセルアナライザプラットフォームの支援を受けたアリシア・マルティネス・ロメロ博士(CIPFサイトメトリー・サービス)に感謝します。
Materials
| 3,5-diethoxycarboxynl-1,4-dihydrocollidine diet (DDC) | TestDiet | 1810704 | Modified LabDiet mouse diet 5015 with 0.1% DDC |
| Alexa Fluor 488 donkey anti-goat IgG (H+L) | Invitrogen | A11055 | Dilution 1:500 |
| Bovine Serum Albumin | Sigma-Aldrich | A7906 | |
| Cryostat Leica CM1850 UV | Leica biosystems | CM1850 UV | Tissue sectioning |
| Fluorescent Mounting medium | Dako | S3023 | |
| GraphPad Prism | GraphPad Software | Prism 8 | Statistical software for graphing data |
| Hoechst 33342 | Sigma-Aldrich | B2261 | Final concentration 5 µg/mL |
| IN Cell Analyzer 1000 | GE Healthcare Bio-Sciences Corp | High-Content Cellular Imaging and Analysis System | |
| MATLAB | MathWorks | R2019a | Data analytics software for automated analysis of nuclear ploidy |
| Microscope coverslides | VWR International | 630-2864 | Size of 24 x 60 mm |
| Microsoft Office Excel | Microsoft | Speadsheet software | |
| OCT Tissue Tek | Pascual y Furió | 4583 | |
| Paraformaldehyde | Panreac AppliChem | 141451.121 | |
| Pen for immunostaining | Sigma-Aldrich | Z377821-1EA | 5mm tip width |
| Polysine Microscope Slides | VWR International | 631-0107 | |
| Rabbit polyclonal Anti-HNF4α | Thermo Fisher Scientific | PA5-79380 | Dilution 1:250 (alternative) |
| Rabit polyclonal Anti-HNF4α | Santa Cruz Biotechnology | sc-6556 | Dilution 1:200 (antibody used in the study) |
| Tween 20 | Sigma-Aldrich | P5927 |
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