En høy-gjennomstrømning i Situ metode for estimering av hepatocytt kjernefysisk ploidy i mus
Summary
Vi presenterer en robust, kostnadseffektiv og fleksibel metode for måling av endringer i hepatocyttall og kjernefysisk plafode innenfor faste/kryobevarte vevsprøver som ikke krever flytcytometri. Vår tilnærming gir en kraftig prøve-wide signatur av leveren cytologi ideell for å spore utviklingen av leverskade og sykdom.
Abstract
Når leveren er skadet, reduseres hepatocyttallet, mens cellestørrelse, kjernefysisk størrelse og ploidy øker. Utvidelsen av ikke-parenchymale celler som cholangiocytter, myofibroblaster, stamfar er og inflammatoriske celler indikerer også kronisk leverskade, vevsremodellering og sykdomsprogresjon. I denne protokollen beskriver vi en enkel høygjennomstrømningstilnærming for beregning av endringer i leverens cellulære sammensetning som er forbundet med skade, kronisk sykdom og kreft. Vi viser hvordan informasjon hentet fra todimensjonale (2D) vevseksjoner kan brukes til å kvantifisere og kalibrere hepatocytkjerne kjernefysisk ploidy i en prøve og gjøre det mulig for brukeren å finne spesifikke ploidy undergrupper i leveren in situ. Vår metode krever tilgang til fast/frosset levermateriale, grunnleggende immuncytokjemireagenser og en hvilken som helst standard høyinnholdsbildeplattform. Det fungerer som et kraftig alternativ til standard flow cytometri teknikker, som krever forstyrrelse av nysamlet vev, tap av romlig informasjon og potensiell disaggregasjon bias.
Introduction
Hepatocytter i pattedyrleveren kan gjennomgå stoppet cytokinese for å produsere tonukleære celler, og DNA-endoreplikasjon for å produsere polyploidkjerner som inneholder opptil 16N DNA-innhold. Samlet cellulær og kjernefysisk ploidy økning under postnatal utvikling, aldring og som svar på ulike cellulære påkjenninger1. Prosessen med polyplaitoisering er dynamisk og reversibel2, selv om den nøyaktige biologiske funksjonen forblir uklar3. Økt plaoidi er forbundet med redusert proliferativ kapasitet4, genetisk mangfold2, tilpasning til kronisk skade5 og kreftbeskyttelse6. Hepatocytt ploidy endringer oppstår som følge av endret døgnrytme7, og avvenning8. Spesielt er den ploidy profilen til leveren endret av skade og sykdom9, og overbevisende bevis tyder på at spesifikke ploidy endringer, for eksempel økt ≥ 8N kjerner eller tap av 2N hepatocytter, gir nyttige signaturer for sporing av ikke-alkoholholdigfettleversykdom (NAFLD) progresjon3,10, eller differensialvirkningen av virusinfeksjoner11.
Generelt er leverskade og regenerering forbundet med økt hepatocytcellestørrelse og kjernefysisk område12, sammen med redusert antall hepatocytter, spesielt de med 2N DNA-innhold10,11. Parenchymal skade i leveren er også ofte ledsaget av utvidelse av ikke-parenchymal celler (NPCer), inkludert stromal myofibroblaster, inflammatoriske celler og bipotente leverstamceller. Høy gjennomstrømningsmetoder som gir en kvantitativ cytologisk profil av parenchymal cellenummer og kjernefysisk plaoidi, samtidig som de tar hensyn til endringer i NPCer, har derfor betydelig potensial som forskning og kliniske verktøy for å spore leverens respons under skade og sykdom. Overbevisende nylig in situ analyse av ploidy spectra i menneskelige prøver av hepatocellulært karsinom viser også at kjernefysisk ploidy er dramatisk økt i svulster og er spesielt forsterket i mer aggressive tumor undertyper med redusert differensiering og tap av TP5313. Derfor er det en sterk mulighet for at metodiske fremskritt i kvantitativ vurdering av kjernefysisk ploidi vil bidra til fremtidig prognostisk profilering av leverkreft.
I denne protokollen er en fleksibel høygjennomstrømningsmetodikk for komparativ analyse av muselevervevseksjoner beskrevet, som gir detaljert cytometrisk profilering av hepatocytttall, NPC-responsen og en internt kalibrert metode for å estimere nukleær ploidi (Figur 1). Hepatocytter skiller seg fra NPCer ved hepatocytt kjernefaktor 4 alfa (HNF4α) immunmerking, før karakterisering av kjernefysisk størrelse og kjernefysisk morfotri. “Minimalt DNA-innhold” er estimert for alle sirkulære kjernefysiske masker ved å integrere gjennomsnittlig Hoechst 33342 intensitet (en proxy for DNA-tetthet) med interpolert tredimensjonalt (3D) kjernefysisk volum. Hepatocytt minimalt DNA-innhold kalibreres deretter ved hjelp av NPCer for å generere en kjernefysisk ploidy profil.
Bildeinnhenting, kjernefysisk segmentering og bildeanalyse utføres ved hjelp av bildebehandling med høyt innhold, slik at store områder av todimensjonale (2D) leverseksjoner som inneholder titusenvis av celler, kan screenes. Et spesialskrevet program er gitt for automatisert etterbehandling av høyinnholdsbildeanalysedata for å produsere en prøveomfattende ploidy profil for alle sirkulære hepatocytkjerner. Dette utføres ved hjelp av gratis å laste ned programvare for å beregne kjernefysisk ploidy basert på stereologisk bildeanalyse (SIA)10,11,14,15. SIA-metoden har tidligere blitt validert av flow cytometri som en nøyaktig, om enn arbeidskrevende metode for å estimere hepatocytkjerne kjernefysisk ploidi i leveren14, forutsatt sirkulær kjernefysisk morfologi og et monotont forhold mellom kjernefysisk størrelse og DNA-innhold. I denne protokollen måles begge kjernefysiske parametere ved vurdering av kjernefysisk morfotri og Hoechst 33342-merking. Beregning av “minimalt DNA-innhold” for hver kjernefysiskmaske etterfølges av kalibrering av hepatocytt kjernefysisk ploidi ved hjelp av NPCer, som har et kjent 2-4N DNA-innhold og derfor tjener som en nyttig internkontroll.
Sammenlignet med konvensjonelle flyt cytometri metoder16 tilnærmingen beskrevet gjør hepatocytt kjernefysisk ploidy å bli vurdert in situ og krever ikke tilgang til friskt vev eller disaggregering metoder som kan skjevhet utfall og være vanskelig å standardisere. Som med alle SIA-baserte tilnærminger, er kjernefysiske ploidy underklasser > 2N underrepresentert av 2D-prøvetaking på grunn av snitting av større kjerner utenfor ekvatorialplanet. Den vevsbrede ploidy profilen beskriver også minimum DNA-innhold for alle sirkulære hepatocytt kjernefysiske masker, og diskriminerer ikke direkte mellom mononukleære hepatocytter og to ukukleære celler som har to diskrete (“ikke-rørende”) kjerner av samme ploidi. Imidlertid gir enkelheten i denne protokollen betydelig rom for at den kan tilpasses for å ta hensyn til flere parametere som internukleær avstand eller celleperimeteranalyse, som ville lette identifisering av tonukleære celler som gir en mer detaljert vurdering av cellulær ploidi.
Protocol
Representative Results
Discussion
En høy-innhold, høy gjennomstrømning tilnærming for analyse av vev remodeling og estimering av hepatocytkjerne nukleær ploidy i murine leveren er beskrevet. Når en kjent med prosedyren, kan en bruker behandle, bildeog analysere flere prøver i en 3-5 dagers periode, og generere store testbare datasett som gir en detaljert signatur av leverhelse. Gitt enkelheten i prøveforberedelsesmetoden, sammen med det store antallet celler og vevsområde analysert (i gjennomsnitt 14 mm2/ prøve), resultatene er robus…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Dette arbeidet ble finansiert av den spanske MINECO regjeringen gir BFU2014-58686-P (LAN) og SAF-2017-84708-R (DJB). LAN ble støttet av en nasjonal MINECO Ramón y Cajal Fellowship RYC-2012-11700 og Plan GenT award (Comunitat Valenciana, CDEI-05/20-C), og FMN av en regional ValI + D studentship av Valencian Generalitat ACIF/2016/020. RP vil gjerne anerkjenne prof. Ewa K. Paluch for finansiering. Vi takker Dr. Alicia Martínez-Romero (CIPF Cytometry service) for hjelp med IN Cell Analyzer-plattformen.
Materials
| 3,5-diethoxycarboxynl-1,4-dihydrocollidine diet (DDC) | TestDiet | 1810704 | Modified LabDiet mouse diet 5015 with 0.1% DDC |
| Alexa Fluor 488 donkey anti-goat IgG (H+L) | Invitrogen | A11055 | Dilution 1:500 |
| Bovine Serum Albumin | Sigma-Aldrich | A7906 | |
| Cryostat Leica CM1850 UV | Leica biosystems | CM1850 UV | Tissue sectioning |
| Fluorescent Mounting medium | Dako | S3023 | |
| GraphPad Prism | GraphPad Software | Prism 8 | Statistical software for graphing data |
| Hoechst 33342 | Sigma-Aldrich | B2261 | Final concentration 5 µg/mL |
| IN Cell Analyzer 1000 | GE Healthcare Bio-Sciences Corp | High-Content Cellular Imaging and Analysis System | |
| MATLAB | MathWorks | R2019a | Data analytics software for automated analysis of nuclear ploidy |
| Microscope coverslides | VWR International | 630-2864 | Size of 24 x 60 mm |
| Microsoft Office Excel | Microsoft | Speadsheet software | |
| OCT Tissue Tek | Pascual y Furió | 4583 | |
| Paraformaldehyde | Panreac AppliChem | 141451.121 | |
| Pen for immunostaining | Sigma-Aldrich | Z377821-1EA | 5mm tip width |
| Polysine Microscope Slides | VWR International | 631-0107 | |
| Rabbit polyclonal Anti-HNF4α | Thermo Fisher Scientific | PA5-79380 | Dilution 1:250 (alternative) |
| Rabit polyclonal Anti-HNF4α | Santa Cruz Biotechnology | sc-6556 | Dilution 1:200 (antibody used in the study) |
| Tween 20 | Sigma-Aldrich | P5927 |
References
- Gentric, G., Desdouets, C. Polyploidization in liver tissue. American Journal of Pathology. 184 (2), 322-331 (2014).
- Duncan, A. W., et al. The ploidy conveyor of mature hepatocytes as a source of genetic variation. Nature. 467 (7316), 707-710 (2010).
- Gentric, G., Desdouets, C. Liver polyploidy: Dr Jekyll or Mr Hide?. Oncotarget. 6 (11), 8430-8431 (2015).
- Wilkinson, P. D., et al. The Polyploid State Restricts Hepatocyte Proliferation and Liver Regeneration in Mice. Hepatology. 69 (3), 1242-1258 (2019).
- Wilkinson, P. D., et al. Polyploid Hepatocytes Facilitate Adaptation and Regeneration to Chronic Liver Injury. The American Journal of Pathology. 189 (6), 1241-1255 (2019).
- Zhang, S., et al. The Polyploid State Plays a Tumor-Suppressive Role in the Liver. Developmental Cell. 44 (4), 447-459 (2018).
- Chao, H. W., et al. Circadian clock regulates hepatic polyploidy by modulating Mkp1-Erk1/2 signaling pathway. Nature Communications. 8 (1), 2238 (2017).
- Celton-Morizur, S., Merlen, G., Couton, D., Margall-Ducos, G., Desdouets, C. The insulin/Akt pathway controls a specific cell division program that leads to generation of binucleated tetraploid liver cells in rodents. Journal of Clinical Investigation. 119 (7), 1880-1887 (2009).
- Wang, M. J., Chen, F., Lau, J. T. Y., Hu, Y. P. Hepatocyte polyploidization and its association with pathophysiological processes. Cell Death & Disease. 8 (5), e2805 (2017).
- Gentric, G., et al. Oxidative stress promotes pathologic polyploidization in nonalcoholic fatty liver disease. Journal of Clinical Investigation. 125 (3), 981-992 (2015).
- Toyoda, H. Changes to hepatocyte ploidy and binuclearity profiles during human chronic viral hepatitis. Gut. 54 (2), 297-302 (2005).
- Miyaoka, Y., et al. Hypertrophy and Unconventional Cell Division of Hepatocytes Underlie Liver Regeneration. Current Biology. 22 (13), 1166-1175 (2012).
- Bou-Nader, M., et al. Polyploidy spectrum: a new marker in HCC classification. Gut. , (2019).
- Danielsen, H., Lindmo, T., Reith, A. A method for determining ploidy distributions in liver tissue by stereological analysis of nuclear size calibrated by flow cytometric DNA analysis. Cytometry. 7 (5), 475-480 (1986).
- Guidotti, J. E., et al. Liver Cell Polyploidization: A Pivotal Role for Binuclear Hepatocytes. Journal of Biological Chemistry. 278 (21), 19095-19101 (2003).
- Severin, E., Meier, E. M., Willers, R. Flow cytometric analysis of mouse hepatocyte ploidy – I. Preparative and mathematical protocol. Cell and Tissue Research. 238 (3), 643-647 (1984).
- Manzano-Núñez, F., et al. Insulin resistance disrupts epithelial repair and niche-progenitor Fgf signaling during chronic liver injury. PLoS Biology. 17 (1), e2006972 (2019).
- Morales-Navarrete, H., et al. A versatile pipeline for the multi-scale digital reconstruction and quantitative analysis of 3D tissue architecture. eLife. 4, e11214 (2015).
- Baratta, J. L., et al. Cellular organization of normal mouse liver: A histological, quantitative immunocytochemical, and fine structural analysis. Histochemistry and Cell Biology. 131 (6), 713-726 (2009).
- Pandit, S. K., et al. E2F8 is essential for polyploidization in mammalian cells. Nature Cell Biology. 14 (11), 1181-1191 (2012).
- Vinogradov, A. E., Anatskaya, O. V., Kudryavtsev, B. N. Relationship of hepatocyte ploidy levels with body size and growth rate in mammals. Genome. 44 (3), 350-360 (2001).
- Tanami, S., et al. Dynamic zonation of liver polyploidy. Cell and Tissue Research. 368 (2), 405-410 (2017).
- Kudryavtsev, B. N., Kudryavtseva, M. V., Sakuta, G. A., Stein, G. I. Human hepatocyte polyploidization kinetics in the course of life cycle. Virchows Archiv B Cell Pathology Including Molecular Pathology. 64 (1), 387-393 (1993).
- Gentric, G., Celton-Morizur, S., Desdouets, C. Polyploidy and liver proliferation. Clinics and Research in Hepatology and Gastroenterology. 36 (1), 29-34 (2012).
- Uhlén, M., et al. Tissue-based map of the human proteome. Science. 347 (6220), 1260419 (2015).
