En allsidig cryoslicing BN-MS-protokoll som bruker en mikrotomen, presenteres for complexome profilering med høy oppløsning.
Proteiner generelt utøve biologiske funksjoner gjennom interaksjoner med andre proteiner, enten i dynamiske protein forsamlinger eller som en del av stabilt dannet komplekser. Sistnevnte kan elegant løses i henhold til molekylær størrelse ved hjelp av Native polyakrylamid gel elektroforese (BN-side). Sammenkobling av slike separasjoner til sensitive masse massespektrometri (BN-MS) har vært veletablert og teoretisk gir en grundig vurdering av utvinnbare complexome i biologiske prøver. Imidlertid er denne tilnærmingen ganske arbeidskrevende og gir begrenset kompleks størrelse oppløsning og følsomhet. Også har sin søknad forble begrenset til rikelig mitokondrie og plastid proteiner. Således, for et flertall av proteiner, er informasjon om integrering i stabile protein komplekser fortsatt mangler. Presentert her er en optimalisert tilnærming for complexome profilering bestående av preparativ-skala BN-side separasjon, sub-millimeter prøvetaking av brede gel baner ved cryomicrotome kutting, og masse spectrometric analyse med etikett-fri protein kvantifisering. Prosedyrene og verktøyene for kritiske trinn er beskrevet i detalj. Som et program, rapporten beskriver complexome analyse av en solubilized endosome-beriket membran brøkdel av mus nyrer, med 2 545 proteiner profilert totalt. Resultatene viser identifisering av uniform, lav overflod membran proteiner som intracellulære ion kanaler samt høy oppløsning, komplekse protein montering mønstre, inkludert glykosylering isoformene. Resultatene er enige med uavhengige biokjemiske analyser. Oppsummert gir denne metodikken for omfattende og objektiv identifisering av protein (super) komplekser og deres delenhet sammensetning, som gir grunnlag for å undersøke støkiometri, montering, og samhandling dynamikk av protein komplekser i noen biologisk system.
BN-side separasjon ble først direkte koplet til LC-MS analyse (BN-MS) av Majeran1 og Wessels2 forskningsgrupper bruker manuell KUTTING av BN-side gel Lanes. Deres analyser identifiserte en rekke rikelig membran protein komplekser med kjent delenhet sammensetning fra plante plastids og HEK celle mitokondrier, henholdsvis. Men disse analysene var langt fra omfattende og tillot ikke for objektiv identifisering av romanen forsamlinger. Utførelsen av masse spektrometre og etikett frie kvantifisering metoder har blitt betydelig forbedret siden den gang, noe som har gjort det mulig med omfattende BN-MS-analyser. Dette har skapt begrepet “complexome profilering”. For eksempel, Heide og kollegaer analysert rotte hjerte mitokondrier identifisere og klynger 464 mitokondrie proteiner, og dermed bekrefter mange kjente forsamlinger. I tillegg fant de TMEM126B å være en roman og avgjørende delenhet av en bestemt forsamling kompleks3. Sammenlignbare resultater (med 437 mitokondrie protein profiler) ble innhentet i en parallell studie av HEK celle mitokondrier4.
Til tross for disse forbedringene, har flere saker forblitt som begrense det fulle potensialet i BN-MS for complexome profilering. En stor begrensning er den effektive størrelses oppløsningen av komplekser som bestemmes av to faktorer: (i) kvaliteten på BN-side separasjon, som avhenger av ensartethet av gel matrise pore gradient samt stabilitet/løselighet av prøven komplekser, og (II) trinn størrelse av gel prøvetaking, som er i beste 1 mm ved bruk av konvensjonell manuell kutting5,6. Dårlig størrelse oppløsning ikke bare bommer subtile komplekse isoformene og heterogeniteter, men også negativt påvirker den dynamiske rekkevidden og tilliten til upartiske, de Novo delenhet oppdrag og kvantifisering.
Andre utfordringer inkluderer presisjonen av protein kvantifisering og dekningen av det faktiske dynamiske spekteret av protein forekomster i prøven ved masse spectrometric analyse. Derfor har anvendelse av BN-MS complexome profilering vært i stor grad begrenset til biologiske prøver med lavere kompleksitet, høye uttrykk for mål komplekser, og gunstige oppløseliggjøringen egenskaper (dvs. plastids, mitokondrier, og mikroorganismer)6,7,8,9,10.
Vi har nylig innført cryomicrotome kutting-assistert BN-MS (csBN-MS), som kombinerer presis sub-millimeter prøvetaking av BN-side gel Lanes med omfattende MS analyse og forseggjort MS databehandling for fastsettelse av protein profiler med høy tilliten11. Påføring på en mitokondrie membran forberedelse fra rotte hjerner viste tidligere unmet effektiv kompleks størrelses oppløsning og maksimal dekning av oksidativt respirasjons kjede kompleks (OXPHOS) under enheter (dvs. 90 av 90 MS-Accessible). Dette eksempelet også identifisert en rekke romanen protein forsamlinger.
Beskrevet her er optimalisert prosedyrer for preparativ skala BN-side separasjon av protein komplekser (ikke begrenset til en bestemt biologisk kilde), støping av store preparativ BN-PAGE gels, cryomicrotome kutting av brede gel Lanes, og MS data Behandling. Ytelse med høy oppløsning profilering er demonstrert for en protein kompleks forberedelse fra mus nyre endosome-beriket membraner. Til slutt diskuteres fordelene fra økende oppløsning og presisjon av masse spectrometric kvantifisering.
Det forevist studere bygget på csBN-MULTIPLE SCLEROSIS teknikk tidligere benchmarked med en mitokondrie forberedelse11 og innlemmet forbedringer inne eksemplar forberedelse, gel bearbeiding, og MULTIPLE SCLEROSIS data bedømmelse. Fokusert analyse av en del av stor skala separasjon BN-side gel gitt et omfattende sett av data som viser kvalitetstiltak sammenlignbare med studien med mitokondrie membraner. Masse og oppbevaring tid feil samt kjøre-til-Run variasjoner ble holdt svært lav og gitt grunnlag for å bestemme pålitelig protein overflod profiler. Størrelses oppløsning så ut til å være god, med halv-maksimal topp bredde så lavt som seks skiver (tilsvarende 1,5 mm, Figur 4) og relative størrelse forskjeller på mindre enn 10% løst (Figur 3, figur 5A). Disse verdiene ikke fullt ut oppfyller størrelsen oppløsning kvaliteten på den forrige csBN-MS analyse av mitokondrier (til tross for mindre gel prøvetaking trinn størrelse valgt), men de er betydelig bedre enn ytelsen til konvensjonelle BN-MS eller størrelse-utelukkelse MS tilnærminger20 som nylig har blitt populært.
Betydningen av en høy effektiv kompleks størrelse oppløsning er understreket av simuleringen eksperimentet i Figur 3 (ved hjelp av TPC1-assosiert komplekser) som kan neppe løses ved 2D BN/SDS-side Western Blot analyse (figur 1B). Disse resultatene tyder på at 0,25 mm kutting i dette tilfellet resulterte i noen oversampling, men det dette fortsatt viste seg å være nyttig for eliminering av “kvantifisering støy” uten å svekke effektiv størrelse oppløsning. Dermed, i tråd med tidligere resultater11, er en samplings trinn størrelse på ~ 0,3 mm generelt anbefales.
Spesielt er diskriminering av TPC1-tilknyttede komplekser helt tapt med 1 mm gel prøvetaking, som er den minste trinn størrelse levert av manuell kutting i konvensjonell BN-MS5,6. Denne kanskje forklare det fakta at til tross for kraftfull MULTIPLE SCLEROSIS teknologiene tilværelse anvendelig, svært få protein komplekser og under enheter ha blitt kjennemerke de Novo av complexome profilering. For resten dens fint løser makt, csBN-MULTIPLE SCLEROSIS tilbyder høy allsidighet. Membran bundne komplekser og løselige protein komplekser som spenner fra 50 kDa til flere MDa kan effektivt løses i et enkelt eksperiment med minimum bias11. Dette kontraster med alternative separasjon teknikker som brukes for complexome profilering som størrelses ekskludering eller ion Exchange kromatografi, som opererer med delsett av løselige proteiner med visse størrelses områder eller lade egenskaper. På nedsiden, csBN-MS er mindre skalerbar (maksimal belastning på ~ 3 mg protein per gel), kan være teknisk utfordrende, og kan ikke automatisert.
Resultatene viser at csBN-MS-baserte complexome profilering kan med hell brukes på ikke-mitokondrie mål, men også indikere noen tilknyttede utfordringer. Dermed effektiv ekstraksjon og biokjemiske stabilitet av protein komplekser krever mer optimalisering, og rengjøring trinn og kan fortsatt være begrenset. Innenfor den undersøkte størrelsen vinduet, antall godt fokuserte, monodisperse protein komplekser var faktisk betydelig lavere (data ikke vist) sammenlignet med en mitokondrie prøve. Det anbefales også å senke BN-side sample laster å få akseptabel gel separasjon. Høyere belastninger kan kreve bredere gel baner som er vanskeligere å behandle riktig for kutting (se med følgende video). Videre var protein kompleksiteten i prøvene høyere (rundt to ganger) enn den mitokondrier skive fordøyer, noe som førte til mer manglende PV verdier og en redusert dynamisk område. Faktisk forventes noen små proteiner å være en del av komplekser vist i figur 5 manglet i analysene. Disse problemene kan løses i fremtiden ved hjelp av raskere og mer følsomme MS instrumenter eller data-uavhengige oppkjøpet moduser.
Prøveklargjøring er svært kritisk for protein kompleks gjenfinning, stabilitet, og gel separasjon kvalitet. Parametre og prosedyrer skal optimaliseres for hvert kilde vev, celle lysat, membran (brøk), og protein kompleks av interesse. Følgende generelle anbefalinger er gitt som kan bidra til å utvide anvendelser av csBN-MS:
(i) forberede prøver friskt og unngå oppvarming/frysing, sterk fortynninger, endringer i buffer forhold, og unødvendige forsinkelser;
(II) bruke buffere som er essensielt blottet for salter (Erstatt med 500-750 mM Betaine eller aminokapronsyre syre), om en nøytral pH, og som inneholder opptil 1% (w/v) av ikke-denaturering vaskemiddel (protein: vaskemiddel ratio mellom 1:4-1:10 for oppløseliggjøringen av membran protein komplekser, ingen vaskemiddel kreves for løselig protein komplekser);
(III) nøye testing og justering av rengjøringsmidler ved analytisk BN-side, siden disse kan sterkt påvirke effektiviteten av komplekse oppløseliggjøringen, representasjon av membran protein komplekser i prøven, stabiliteten, og homogenitet av protein-vaskemiddel miceller. Sistnevnte er forutsetninger for proteiner å fokusere som distinkte band/komplekse populasjoner på BN-side gels. Tidligere litteratur tilbyr et bredt spekter av nøytrale vaskemidler. Men DDM (n-natriumdodecylsulfat β-d-maltoside)1,2,4,5,6 og digitonin3,5,7,8, 9,10,13,18 har vært de mest populære valgene for BN-MS analyser så langt. Det må understrekes at enhver vaskemiddel tilstand nødvendigvis utgjør et kompromiss mellom oppløseliggjøringen effektivitet og bevaring av protein interaksjoner og er kanskje ikke like egnet for alle typer mål protein og kildemateriale;
(IV) fjerning av ladet polymerer som fibrils, filamenter, polylysine, DNA, og rikelig med lavere molekylvekt komponenter (dvs. metabolitter, lipider, eller peptider). Dette kan oppnås ved ultracentrifugation, gel filtrering, eller dialyse. Dette er spesielt viktig for total celle eller vev lysater;
(v) legge til Coomassie G-250 (endelig konsentrasjon 0,05%-0,1%) og sukrose (for å øke tettheten for lasting, endelig konsentrasjon 10%-20% [w/v]) til prøven like før lasting, for å klare av korte ultracentrifugation, laste prøven uten forstyrrelsene, og starte kjøre umiddelbart etterpå.
Som et fremtidig perspektiv, csBN-MS-baserte complexome profilering tilbyr alternativer for multipleksing å studere protein kompleks dynamikk eller endringer knyttet til spesifikke biologiske forhold. Kombinert separasjon av metabolically merkede prøver som foreslått for størrelsesbasert profilering21 vises grei, men det kan være hemmet av spontan delenhet utveksling i komplekser forekommer uavhengig av brukt separasjon Metoden. Alternativt kan merket prøvene løses i nærliggende gel baner, som deretter kan co-skiver eller kombinert post-fordøye for differensial analyse med høy følsomhet og robusthet.
The authors have nothing to disclose.
Denne studien ble støttet av Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG, tysk forskningsstiftelse) – prosjekt-ID 403222702 – SFB 1381 og under Tysklands Excellence Strategy CIBSS-eks-2189-prosjekt-ID 390939984. Vi takker Katja zappe for teknisk assistanse.
30% Acrylamide/Bis Solution, 37.5:1 | Bio Rad | #1610158 | Recommended for acrylamide gradient gel solutions up to 13% |
30% Acrylamide/Bis Solution, 19:1 | Bio Rad | #1610154 | Recommended for acrylamide gradient gel solutions >13% |
SYPRO Ruby Protein Blot Stain | Bio Rad | #1703127 | Total protein stain on blot membranes; sensitive and compatible with immunodetection |
Coomassie Brilliant Blue G-250 | Serva | no. 35050 | Centrifugate stock solutions prior to use |
ComplexioLyte 47 | Logopharm | CL-47-01 | Ready-to-use detergent buffer (1%) for mild solubilization of membrane proteins |
Embedding Medium / Tissue Freezing Medium | Leica Biosystems | 14020108926 | Embedding medium for gel sections to be sliced by a cryo-microtome |
Immobilon-P Membrane, PVDF, 0,45 µm | Merck | IPVH00010 | |
ECL Prime Western Blotting Detection Reagent | GE Healthcare | RPN2232 | |
Plastic syringe with rubber stopper, 20-30 ml | n.a. | n.a. | any supplier, important for making gel section embedding tool |
broad razor blade | n.a. | n.a. | any supplier, for BN-PAGE gel trimming / excision of lanes |
metal tube / cylinder, ca. 4 cm long | n.a. | n.a. | mold for embedding and freezing of gel samples |
Protein LoBind Tubes, 1.5 ml | Eppendorf | Nr. 0030108116 | highly recommended to minimize protein/peptide loss due to absorption |
sequencing-grade modified trypsin | Promega | V5111 | |
C18 PepMap100 precolumn, particle size 5 µm | Dionex / Thermo Scientific | P/N 160454 | |
PicoTip emitter (i.d. 75 µm; tip 8 µm) | New Objective | FS360-75-8 | |
ReproSil-Pur 120 ODS-3 (C18, 3 µm) | Dr. Maisch GmbH | r13.93. | columns packed manually |
rabbit anti-TPC1 antibody | Gramsch Laboratories | custom production | described in Castonguay, et al., 2017 (Reference 12) |
Cy3-biotinylated goat anti-rabbit IgG | Vector Laboratories | CY-1300 | described in Castonguay, et al., 2017 (Reference 12) |
biotinylated Lotus tetragonolobus lectin, FITC-conjugated | Vector Laboratories | #B1325 | described in Castonguay, et al., 2017 (Reference 12) |
cryo-microtome Leica CM1950 | Leica Biosystems | 14047743905 | |
Mini Protean II Cell with wetblot unit | Bio Rad | n.a. | for SDS-PAGE and Westernblot (not sold any more) |
Penguin Midi Gel Electrophoresis System | PeqLab | n.a. | for BN-PAGE (not sold any more) |
Zeiss Axiovert 200 M microscope + Photometrics Coolsnap 2 digital camera | Zeiss / Photometrics | n.a. | |
peristaltic pump (IP high precision multichannel) | Ismatec | ISM940 | for casting of gradient polyacrylamide gels |
gradient mixer with stirring (two chambers) | selfmade, alternatively Bio Rad | 1652000 or 1652001 | for casting of gradient polyacrylamide gels, manual provides instructions to cast linear or hyperbolic gradient gels (http://www.bio-rad.com/webroot/web/pdf/lsr/literature/M1652000.pdf) |
ultracentrifuge Sorvall M120 with S80 AT3 rotor | Sorvall / Thermo Scientific | n.a. | for sample preparation (not sold any more) |
UltiMate 3000 RSLCnano HPLC | Dionex / Thermo Scientific | ULTIM3000RSLCNANO | |
Orbitrap Elite mass spectrometer | Thermo Scientific | IQLAAEGAAPFADBMAZQ |