Immunoglobuline G N-Glycan Analysis par Ultra-Performance Liquid Chromatography

Di Liu; Xizhu Xu; Yuejin Li; Jie Zhang; Xiaoyu Zhang; Qihuan Li; Haifeng Hou; Dong Li; Wei Wang; Youxin Wang

doi:10.3791/60104

Method Article

Immunoglobuline G N-Glycan Analysis par Ultra-Performance Liquid Chromatography

DOI:

10.3791/60104

⸱

January 18th, 2020

Di Liu*¹ , Xizhu Xu*² , Yuejin Li² , Jie Zhang¹ , Xiaoyu Zhang¹ , Qihuan Li¹ , Haifeng Hou² , Dong Li² , Wei Wang¹^,²^,³ , Youxin Wang¹

¹Beijing Key Laboratory of Clinical Epidemiology, School of Public Health, Capital Medical University, ²School of Public Health, Shandong First Medical University & Shandong Academy of Medical Sciences, ³School of Medical and Health Sciences, Edith Cowan University

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Immunoglobulin G (IgG) N-glycanest caractérisé en utilisant la chromatographie d'interaction hydrophile UPLC. En outre, la structure de IgG N-glycan est clairement séparée. Présenté ici est une introduction à cette méthode expérimentale afin qu'il puisse être largement utilisé dans les milieux de recherche.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Glycomics est une nouvelle sous-spécialité dans la recherche sur les systèmes d'omiques qui offre un potentiel significatif dans la découverte de biomarqueurs de prochaine génération pour la susceptibilité aux maladies, la découverte de cibles médicamenteuses et la médecine de précision. D'autres IgG N-glycans ont été rapportés dans plusieurs maladies chroniques communes et suggérés pour avoir le grand potentiel dans des applications cliniques (c.-à-d., biomarqueurs pour le diagnostic et la prévision des maladies). IgG N-glycans sont largement caractérisés en utilisant la méthode de chromatographie d'interaction hydrophile (HILIC) chromatographie liquide ultra-performance (UPLC). UPLC est une technologie de détection stable avec une bonne reproductibilité et une précision quantitative relative élevée. En outre, la structure de L'IgG N-glycan est clairement séparée, et la composition de glycane et l'abondance relative dans le plasma sont caractérisées.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

N-glycosylation des protéines humaines est une^modification post-traduction n 1 commune et essentielle et peut aider à prédire l'occurrence et le développement des maladies de façon relativement précise. En raison de la complexité de sa structure, on s'attend à ce qu'il y ait plus de 5 000 structures de glycane, offrant un grand potentiel en tant que biomarqueurs diagnostiques et prédictifs pour les maladies². N-glycansattachés à l'immunoglobuline G (IgG) se sont avérés essentiels pour la fonction d'IgG, et IgG N-glycosylation participe à l'équilibre entre les systèmes pro- et anti-inflammatoire....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Tous les sujets inclus dans le protocole ont été approuvés par le Comité d'éthique de l'Université médicale de la capitale, Beijing, Chine¹². Le consentement éclairé écrit a été obtenu de chaque sujet au début de l'étude.

1. IgG isolement

Préparer les produits chimiques, y compris le tampon de liaison (saline tamponnée de phosphate, PBS) : 1x PBS (pH à 7,4), tampon neutralisant : 10x PBS (pH à 6,6-6,8), eluent : 0,1 M d'acide formique (pH à 2,5), solution neutralisante pour l'éluence : 1 M de bicarbonate d'ammonium, tampon stocké : 20 % éthanol 20 mM Tris 0,1 M NaCl (pH 7,4), solution de nettoyage pour la p....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Comme le montre la figure 1, IgG N-glycansont été analysés en 24 pics initiaux de glycane IgG (GP) basés sur la position de pointe et le temps de rétention. Les structures N-glycansont disponibles par la détection de spectrométrie de masse selon une étude précédente ( tableau1)¹⁵. Pour s'assurer que les résultats étaient comparables, la normalisation totale de la superficie a été appliquée, dans laque.......

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

L'UPLC sert de méthode d'analyse quantitative relative⁵^,¹⁵. Les résultats indiquent que l'UPLC est une technologie de détection stable avec une bonne reproductibilité et une précision quantitative relative. La quantité de glycanes dans chaque pic est exprimée en pourcentage de la superficie totale intégrée à l'aide de l'UPLC, qui est la valeur relative. La quantification relative améliore la comparabilité des échantillons d'essai. En outre, 96 plaques de protéine.......

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Les auteurs n'ont rien à révéler.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ces travaux ont été appuyés par des subventions de la National Natural Science Foundation of China (81673247 et 81872682) et de la subvention collaborative Australie-Chine (NH et MRC - APP1112767 -NSFC 81561128020).

....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
Name	Company	Catalog Number
2-aminobenzamide, 2-AB	Sigma, Chine
Plaque de collecte à 96 puits	AXYGEN
Plaque filtrante à 96 puits	Pol	0,45 um GHP
Plaque monolithique à 96 puits	BIA Séparations
Rotor à plaques à 96 puits	Eppendorf Co., Ltd, Allemagne	T_1087461900
Acide acétique	Sigma, Chine
Acetonitrile	Huihai Keyi Technology Co., Ltd, Chine
Bicarbonate d’ammonium	Shenggong Biological Engineering Co., Ltd, Chine
Formate d’ammonium	Beijing Minruida Technology Co., Ltd.
Incubateur / bascule à agitation constante	Zhicheng analytical instrument manufacturing co., Ltd, Chine	ZWY-10313
Échelle d’étalonnage en dextran / colonne glycopeptide	Watts technology Co., Ltd, Chine	Colonne
Diméthyl sulfoxyde (DMSO)	Sigma, Chine
Phosphate disodique	Shenggong Biological Engineering Co., Ltd, Chine
Fours électriques	Tester instruments Co., Ltd	202-2AB
Empower 3.0	Waters technology Co., Ltd, Amérique
Ethanol	Huihai Keyi Technology Co., Ltd, Chine
Acide formique	Sigma, Chine
GlycoProfile 2-AB Kit d’étiquetage	Sigma, Chine
HCl	Junrui Biotechnology Co., Ltd, Chine
Centrifugeuse à grande vitesse	Eppendorf Co., Ltd, Allemagne	5430
Igepal	Sigma, Chine
Centrifugeuse à basse température	Eppendorf Co., Ltd, Allemagne
Réfrigérateur à basse température	Qingdao Haier Co., Ltd
Collecteur à plaque 96 puits	Technologie Watts Co., Ltd, Chine	186001831
Méthanol	Huihai Keyi Technology Co., Ltd, Chine
Compteur d’eau pure Milli-Q Millipore	Co., Ltd, America	Advantage A10
NaOH	Shenggong Biological Engineering Co., Ltd, Chine
Testeur de PH	Sartorius Co., Ltd, Allemagne	PB-10
Saline tamponnée au phosphate, PBS	Shenggong Biological Engineering Co., Ltd, Chine
Pipette	Eppendorf Co., Ltd, Allemagne	4672100, 0.5-10&mu ; l & 10 à 100 mu ; l & 20 à 200 mu ; l & 1000&mu ;
PNGase F enzyme	Sigma, Chine
Dihydrogénophosphate de potassium	Shenggong Biological Engineering Co., Ltd, Chine
Propan-2-ol	Huihai Keyi Technology Co., Ltd, Chine
SDS	Sigma, Chine
Chlorure de sodium	Shenggong Biological Engineering Co., Ltd, Chine
Cyanoborohydrure de sodium (NaBH3CN)	Sigma, Chine
Spectrophotomètre	Shanghai Yuanxi instrument Co., Ltd	B-500
Pistolet à liquide de transfert	Smer Fell Science and Technology Co., Ltd, Chine	4672100
Tris	Amresco, Amérique
Réfrigérateur à ultra-basse température	Thermo Co., Ltd, Amérique	MLT-1386-3-V ; MDF-382E
Chromatographie liquide ultra-performante	Watts technology Co., Ltd, Chine	Acquity MLtraPerformance LC
Pompe à vide	Watts technology Co., Ltd, Chine	725000604
Volatilisateur/Sécheur	Eppendorf Co., Ltd, Allemagne	T_1087461900
Vortex	Changzhou Enpei instrument Co., Ltd, Chine	NP-30S
de test à bain d’eau	Co., Ltd	DK-98-IIA
Balance de pesée	Shanghai Jingke Scientific Instrument Co., Ltd.	Réf. MP200B

BEHlInstruments

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Kolarich, D., Lepenies, B., Seeberger, P. H. Glycomics, glycoproteomics and the immune system. Current Opinion in Chemical Biology. 16, 214(2012).
Cummings, R., Pierce, J. M. The Challenge and Promise of Glycomics. Chemistry Biology. 21 (1), (2014).
Shade, K. T.....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Immunoglobuline G N-Glycan Analysis par Ultra-Performance Liquid Chromatography

In This Article

Summary

Abstract

Introduction

Protocol

Results

Discussion

Disclosures

Acknowledgements

Materials

References

Reprints and Permissions

Tags

Related Articles