Immunoglobulin G (IgG) N-glycanest caractérisé en utilisant la chromatographie d'interaction hydrophile UPLC. En outre, la structure de IgG N-glycan est clairement séparée. Présenté ici est une introduction à cette méthode expérimentale afin qu'il puisse être largement utilisé dans les milieux de recherche.
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Article de méthode
Immunoglobuline G N-Glycan Analysis par Ultra-Performance Liquid Chromatography
* These authors contributed equally
Dans cet article
Résumé
Résumé
Glycomics est une nouvelle sous-spécialité dans la recherche sur les systèmes d'omiques qui offre un potentiel significatif dans la découverte de biomarqueurs de prochaine génération pour la susceptibilité aux maladies, la découverte de cibles médicamenteuses et la médecine de précision. D'autres IgG N-glycans ont été rapportés dans plusieurs maladies chroniques communes et suggérés pour avoir le grand potentiel dans des applications cliniques (c.-à-d., biomarqueurs pour le diagnostic et la prévision des maladies). IgG N-glycans sont largement caractérisés en utilisant la méthode de chromatographie d'interaction hydrophile (HILIC) chromatographie liquide ultra-performance (UPLC). UPLC est une technologie de détection stable avec une bonne reproductibilité et une précision quantitative relative élevée. En outre, la structure de L'IgG N-glycan est clairement séparée, et la composition de glycane et l'abondance relative dans le plasma sont caractérisées.
Introduction
N-glycosylation des protéines humaines est unemodification post-traduction n 1 commune et essentielle et peut aider à prédire l'occurrence et le développement des maladies de façon relativement précise. En raison de la complexité de sa structure, on s'attend à ce qu'il y ait plus de 5 000 structures de glycane, offrant un grand potentiel en tant que biomarqueurs diagnostiques et prédictifs pour les maladies2. N-glycansattachés à l'immunoglobuline G (IgG) se sont avérés essentiels pour la fonction d'IgG, et IgG N-glycosylation participe à l'équilibre entre les systèmes pro- et anti-inflammatoire....
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Protocole
Tous les sujets inclus dans le protocole ont été approuvés par le Comité d'éthique de l'Université médicale de la capitale, Beijing, Chine12. Le consentement éclairé écrit a été obtenu de chaque sujet au début de l'étude.
1. IgG isolement
- Préparer les produits chimiques, y compris le tampon de liaison (saline tamponnée de phosphate, PBS) : 1x PBS (pH à 7,4), tampon neutralisant : 10x PBS (pH à 6,6-6,8), eluent : 0,1 M d'acide formique (pH à 2,5), solution neutralisante pour l'éluence : 1 M de bicarbonate d'ammonium, tampon stocké : 20 % éthanol 20 mM Tris 0,1 M NaCl (pH 7,4), solution de nettoyage pour la p....
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Résultats
Comme le montre la figure 1, IgG N-glycansont été analysés en 24 pics initiaux de glycane IgG (GP) basés sur la position de pointe et le temps de rétention. Les structures N-glycansont disponibles par la détection de spectrométrie de masse selon une étude précédente ( tableau1)15. Pour s'assurer que les résultats étaient comparables, la normalisation totale de la superficie a été appliquée, dans laque.......
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Discussion
L'UPLC sert de méthode d'analyse quantitative relative5,15. Les résultats indiquent que l'UPLC est une technologie de détection stable avec une bonne reproductibilité et une précision quantitative relative. La quantité de glycanes dans chaque pic est exprimée en pourcentage de la superficie totale intégrée à l'aide de l'UPLC, qui est la valeur relative. La quantification relative améliore la comparabilité des échantillons d'essai. En outre, 96 plaques de protéine.......
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Déclarations de divulgation
Les auteurs n'ont rien à révéler.
Remerciements
Ces travaux ont été appuyés par des subventions de la National Natural Science Foundation of China (81673247 et 81872682) et de la subvention collaborative Australie-Chine (NH et MRC - APP1112767 -NSFC 81561128020).
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Matériaux
| Nom | Entreprise | Numéro de catalogue | Commentaires |
|---|---|---|---|
| 2-aminobenzamide, 2-AB | Sigma, Chine | ||
| Plaque de collecte à 96 puits | AXYGEN | ||
| Plaque filtrante à 96 puits | Pol | 0,45 um GHP | |
| Plaque monolithique à 96 puits | BIA Séparations | ||
| Rotor à plaques à 96 puits | Eppendorf Co., Ltd, Allemagne | T_1087461900 | |
| Acide acétique | Sigma, Chine | ||
| Acetonitrile | Huihai Keyi Technology Co., Ltd, Chine | ||
| Bicarbonate d’ammonium | Shenggong Biological Engineering Co., Ltd, Chine | ||
| Formate d’ammonium | Beijing Minruida Technology Co., Ltd. | ||
| Incubateur / bascule à agitation constante | Zhicheng analytical instrument manufacturing co., Ltd, Chine | ZWY-10313 | |
| Échelle d’étalonnage en dextran / colonne glycopeptide | Watts technology Co., Ltd, Chine | Colonne | |
| Diméthyl sulfoxyde (DMSO) | Sigma, Chine | ||
| Phosphate disodique | Shenggong Biological Engineering Co., Ltd, Chine | ||
| Fours électriques | Tester instruments Co., Ltd | 202-2AB | |
| Empower 3.0 | Waters technology Co., Ltd, Amérique | ||
| Ethanol | Huihai Keyi Technology Co., Ltd, Chine | ||
| Acide formique | Sigma, Chine | ||
| GlycoProfile 2-AB Kit d’étiquetage | Sigma, Chine | ||
| HCl | Junrui Biotechnology Co., Ltd, Chine | ||
| Centrifugeuse à grande vitesse | Eppendorf Co., Ltd, Allemagne | 5430 | |
| Igepal | Sigma, Chine | ||
| Centrifugeuse à basse température | Eppendorf Co., Ltd, Allemagne | ||
| Réfrigérateur à basse température | Qingdao Haier Co., Ltd | ||
| Collecteur à plaque 96 puits | Technologie Watts Co., Ltd, Chine | 186001831 | |
| Méthanol | Huihai Keyi Technology Co., Ltd, Chine | ||
| Compteur d’eau pure Milli-Q Millipore | Co., Ltd, America | Advantage A10 | |
| NaOH | Shenggong Biological Engineering Co., Ltd, Chine | ||
| Testeur de PH | Sartorius Co., Ltd, Allemagne | PB-10 | |
| Saline tamponnée au phosphate, PBS | Shenggong Biological Engineering Co., Ltd, Chine | ||
| Pipette | Eppendorf Co., Ltd, Allemagne | 4672100, 0.5-10&mu ; l & 10 à 100 mu ; l & 20 à 200 mu ; l & 1000&mu ; | |
| PNGase F enzyme | Sigma, Chine | ||
| Dihydrogénophosphate de potassium | Shenggong Biological Engineering Co., Ltd, Chine | ||
| Propan-2-ol | Huihai Keyi Technology Co., Ltd, Chine | ||
| SDS | Sigma, Chine | ||
| Chlorure de sodium | Shenggong Biological Engineering Co., Ltd, Chine | ||
| Cyanoborohydrure de sodium (NaBH3CN) | Sigma, Chine | ||
| Spectrophotomètre | Shanghai Yuanxi instrument Co., Ltd | B-500 | |
| Pistolet à liquide de transfert | Smer Fell Science and Technology Co., Ltd, Chine | 4672100 | |
| Tris | Amresco, Amérique | ||
| Réfrigérateur à ultra-basse température | Thermo Co., Ltd, Amérique | MLT-1386-3-V ; MDF-382E | |
| Chromatographie liquide ultra-performante | Watts technology Co., Ltd, Chine | Acquity MLtraPerformance LC | |
| Pompe à vide | Watts technology Co., Ltd, Chine | 725000604 | |
| Volatilisateur/Sécheur | Eppendorf Co., Ltd, Allemagne | T_1087461900 | |
| Vortex | Changzhou Enpei instrument Co., Ltd, Chine | NP-30S | |
| de test à bain d’eau | Co., Ltd | DK-98-IIA | |
| Balance de pesée | Shanghai Jingke Scientific Instrument Co., Ltd. | Réf. MP200B |
Références
- Kolarich, D., Lepenies, B., Seeberger, P. H. Glycomics, glycoproteomics and the immune system. Current Opinion in Chemical Biology. 16, 214(2012).
- Cummings, R., Pierce, J. M. The Challenge and Promise of Glycomics. Chemistry Biology. 21 (1), (2014).
- Shade, K. T.....
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