Murine kirurgisk model af aktuel elastase induceret faldende Thoracic aorta aneurisme

Summary

Vi beskriver en kirurgisk protokol til konsekvent at inducere robust nedadgående thorax aorta aneurismer i mus. Proceduren involverer venstre thoracotomi, thorax aorta eksponering, og placering af en svamp gennemblødt i Porcin pancreas elastase på aorta væggen.

Abstract

Ifølge Center for Disease Control, aorta aneurismer (AAs) blev betragtet som en førende dødsårsag i alle racer og begge køn fra 1999-2016. En aneurisme former som følge af progressiv svækkelse og eventuel dilatation af aorta, som kan Bristning eller rive, når den når en kritisk diameter. Aneurismer af den faldende aorta i brystet, kaldet faldende thorax aorta aneurismer (dtaa), udgør en stor del af aneurisme tilfælde i USA. Uindesluttet dTAA ruptur er næsten universelt dødbringende, og elektiv reparation har en høj sygelighed og dødelighed. Formålet med vores model er at studere dTAA specifikt, at belyse patofysiologien af dTAA og at søge efter molekylære mål at standse væksten eller reducere størrelsen af dTAA. Ved at have en murine model til at studere thorax patologi præcist, målrettede terapier kan udvikles til specifikt at teste dtaa. Metoden er baseret på placeringen af Porcin bugspytkirtel elastase (PPE) direkte på den ydre murine aorta væggen efter kirurgisk eksponering. Dette skaber en destruktiv og inflammatorisk reaktion, som svækker aorta væggen og giver mulighed for aneurisme dannelse over uger til måneder. Selvom murine modeller besidder begrænsninger, producerer vores dTAA-model robuste aneurismer af forudsigelig størrelse. Desuden kan denne model bruges til at teste genetiske og farmaceutiske mål, som kan arrestere dTAA vækst eller forhindre ruptur. I humane patienter, interventioner som disse kunne hjælpe med at undgå aneurisme ruptur, og vanskelige kirurgiske indgreb.

Introduction

Formålet med denne metode er at studere udvikling, Patofysiologi, og strukturelle ændringer i murine faldende thorax aorta under aortaaneurisme dannelse. Vores model tilbyder en reproducerbar og konsekvent metode til at inducere thorax aorta aneurismer (dtaa) i mus, hvilket gør det muligt at afprøve forskellige genetiske og farmakologiske hæmmere. Dette arbejde kan hjælpe med at identificere stoffer og genterapier, som kan oversættes til en levedygtig behandlingsstrategi for mennesker med dTAA-sygdom.

dtaas form, når væggen af thorax aorta bliver svækket og udvider over tid, indtil de når en kritisk diameter, når rive eller ruptur kan derefter forekomme. Klinisk, dTAA kan fremskridt i stilhed, stigende i størrelse, indtil strukturen i aorta væggen er så forvrænget, at det i sidste ende mislykkes, med katastrofale konsekvenser. Concerningly, symptomer normalt udvikler kun, når aneurisme har nået en farefuld størrelse (100-150% dilatation) og er i høj risiko for dissektion eller ruptur^1,2. dtaa brud er næsten universelt dødbringende³, og elektiv kirurgisk reparation bærer signifikant sygelighed^4,5. Endvidere, de fleste patienter bærer diagnosen af en aorta aneurisme i ca 5 år før kirurgisk reparation^6,7. Dette vindue er et belejligt tidspunkt til at intervenere ikke-kirurgisk. Således, medicinske behandlinger til behandling eller langsom progression af dTAA er nødvendige og ville repræsentere en betydelig avancement på området for aneurisme forskning. Der er i øjeblikket ingen medicinske behandlinger for dTAA tilgængelige, mest på grund af en ufuldstændig forståelse af dTAA patogenesen.

I løbet af de sidste 20 år er flere dTAA dyremodeller blevet udviklet, men hver af disse modeller var adskilte fra vores egen og producerede ikke robuste aneurismer. En murine dTAA model mest ligner vores blev udviklet af Ikonomidis et al.⁸, som omfatter direkte anvendelse af CaCl₂ til adventitia af aorta. Selvom vores model blev tilpasset fra mange af de teknikker, der er fremlagt af Ikonomidis, er vores model unik på tre forskellige måder. Første, i vores model aorta er udsat for aktuel elastase i 3-5 minutter, sammenlignet med 15 minutter af CaCl₂ eksponering. Anden, aorta dilatation forekommer i 2 uger, sammenlignet med 16 uger i CaCl₂ model. Sidst, vores model konsekvent producerer aneurismer på ca 100% dilatation, sammenlignet med aorta dilatationer af 20-30% produceret af CaCl₂ ansøgning (som ikke kan virkelig betragtes aneurismer, da de er defineret som en stigning i aorta diameter > 50%). Der er andre ikke-kirurgiske murine modeller af aneurisme dannelse, såsom APO E knockout Mouse, som danner robuste aneurismer med infusion af angiotensin II. Men, disse mus udvikle Supra-renal eller stigende thorax aorta aneurismer snarere end aneurismer specifikt i den nedadgående thorax aoric^9,10.

Den rationelle for denne protokol er at have en enkel, billig, og tid egnet måde at studere dTAA i en murine model. Musemodellen giver en unik mulighed for at udnytte mange genetiske og celle-specifikke Knockouts, der har været fundet at være virkningsfulde i andre Vaskulære sygdomme. Brugen af vores specifikke TAA-model er blevet godt modtaget, og eksperimenter, der udnytter den, er blevet offentliggjort i high impact-tidsskrifter^11,12. Til dette punkt, modellen er blevet anvendt til at undersøge mulige genetiske og farmakologiske behandlinger, der havde en signifikant effekt i den abdominale aorta aneurisme (AAA) murine modeller; men da vores laboratorium har udvidet brugen af dTAA-modellen, er vi ved at finde mål, der er unikke for dTAA-dannelse, som kan anvendes som målrettede terapier hos mennesker.

Denne model er mest egnet til laboratorier, der har murine mikro-kirurgiske kapaciteter. Selv om det er teknisk udfordrende, det kan udføres konsekvent selv af forskere uden forudgående kirurgisk erfaring. For en forsker uden murine kirurgisk erfaring kan modellen beherskes i ca. 20 operative sessioner (eller ca. 50 mus). For forskeren med forudgående kirurgisk erfaring, kan modellen beherskes i 5 operative sessioner (ca. 20 mus). Vi tror med en høj kvalitet video, tid til beherskelse kan reduceres yderligere. Når færdigheden er opnået, kan proceduren afsluttes i 35 minutter for operationen, og 20 minutter for terminalen høst. Kirurger i vores laboratorium kan fuldføre 10-12 fuld kirurgi per dag, med en udløsende dødelighed på 5-10%. Den mest almindeligt forekommende årsag til dødelighed er lungeskade ved indtræden i brystet, bedøvelse toksicitet, eller ælde af aorta under dissektion. Ud over dtaa forskning, denne model fungerer også som en guide til sikker og nem adgang til thorax aorta og lunge hilum for forskere, der studerer andre interventioner i brystet.

Protocol

Dyre protokoller blev godkendt af University of Virginia Institutionsudvalg for dyrepasning og-brug (nr. 3634). 1. induktion af anæstesi og intubation Placer en 8-10-ugers gammel mandlig C57BL/6 mus i et lukket kammer med kontinuerlig strøm af 5% isofluran og oxygen blanding i 5 min, indtil respirationer er synligt bremset.Bemærk: forskellige stammer, køn og alder af mus kan anvendes afhængigt af forsøgsprotokollen. Hunmus kan være vanskeligere at intubate på grund af min…

Representative Results

Anvendelsen af vores protokol resulterer i robust dTAA i mus sammenlignet med saltvand kontrol. De udviklede TAAs er fusiform i form og forekommer kun i den behandlede del af aorta (figur 1 og figur 2)11. Figur 2 viser et eksempel på en video mikrometri måling ved vævs høst. Ved hjælp af ligning 1, aorta dilatation er 130% i dette eksempel. Den oprindelige undersøgelse af Joh…

Discussion

Thorax og abdominal aorta er cellulært og embryo logisk adskilte, hvilket er relevant for Aneurysmal sygdom^14,15,16. Derfor er der behov for en specifik dyremodel for at studere TAA. Selvom andre murine dTAA modeller er blevet offentliggjort⁸, vores er den eneste model til at skabe faldende thorax aorta dilatation, som kan betragtes virkelig Aneurysmal (over 50% dilation). Desuden er vores model relativt…

Materials

Angiocatheter (22G)			Used for ET Tube
Dumont Tweezers; Pattern #7 x2	Roboz	RS-4982
Graefe Tissue Forceps	Roboz	RS-5158
Harms Forceps x2	Roboz	RS-5097
Intracardiac Needle Holder; Extra Delicate; Carbide Jaws; 7" Length	Roboz	RS-7800
KL 1500 LED Light Source	Leica	150-400
M205A Dissction Microscope	Leica	CH 94-35
Iris Scissors, 11cm, Tungsten Carbide	World Precision Instruments	500216-G
Metal Clip board			Use with the Mouse Retractor Set
Mouse Retractor Set	Kent	SURGI-5001	Need 2 short and 1 tall fixators
Mouse Ventilator MiniVent Type 845, 115 V, Power Supply with US Connector	Harvard Apparatus	73-0043	MiniVent Ventilator for Mice (Model 845), Single Animal, Volume Controlled
Sigma Aldrich	Elastase from porcine pancreas	E0258-50MG	Can be purchased in various size bottles
Small Vessel Cauterizer Kit	Fine Science Tools	18000-00	Recommend using rechargable AA batteries
Spring Scissors, 10.5cm	World Precision Instruments	14127
Steril Swabs (Sponges)	Sugi	31603	Can be cut to size
Surgi Suite Surgical Platform	Kent		Attach to clip board
Tech IV Isoflurane Vap	Jorgensen Laboratories	J0561A	Anesthesia vaporizer