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Biochimie

赤外線ナノ分光法と原子間力顕微鏡による個々のタンパク質凝集物の特徴付け

Published: September 12, 2019
doi:
10.3791/60108
, , , ,
1Centre for Misfolding Diseases, Department of Chemistry,University of Cambridge, 2Institute of Biotechnology, Life Sciences Center,Vilnius University, 3Cavendish Laboratory, Department of Physics,University of Cambridge

Summary

赤外線ナノ分光法と高分解能原子間近顕微鏡の応用を用いて、タンパク質自己組織化のプロセスをオリゴメラ凝集体とアミロイド線維に可視化し、発症と発達に密接に関連している。ヒト神経変性疾患の広い範囲の。

Abstract

タンパク質の誤折と凝集の現象は、アルツハイマー病やパーキンソン病などの神経変性状態に関連する高度に異種タンパク質凝集体の形成をもたらします。特に低分子量凝集体は、アミロイドオリゴマーが、一般的な細胞傷害性を有することが示されており、認知症の多くの形態において神経毒として関与している。原子間力顕微鏡(AFM)に基づく方法を用いて、従来の構造を用いて研究が困難なこれらの集合体の形態的、構造的、化学的特性を特徴付けるという困難な課題に取り組む方法を示す。その不均一性と一過性の性質のために、方法またはバルク生物物理学的方法。スキャンプローブ顕微鏡アプローチは、サブナノメートル分解能を持つアミロイド凝集体の形態を調製できるようになりました。ここでは、AFMの高分解能とIR分光法の化学認識力を同時に利用する赤外線(IR)ナノ分光法(AFM-IR)が、個々の構造特性の特性をさらに高め、特性の特性を高めることができることを示します。タンパク質凝集体を提供し、集約メカニズムに関する洞察を提供します。我々が説明するアプローチは、低分子および抗体とのタンパク質アセンブリの相互作用の調査にも適用することができるので、診断または治療するための新しい治療化合物を開発するための基本的な情報を提供することができます神経変性疾患。

Introduction

現在、世界中で4,000万人以上の人々が、アルツハイマー病(AD)1やパーキンソン病(PD)2疾患などの神経変性疾患の影響を受けています。より一般的には、50以上の病理がタンパク質の誤折と凝集と分子レベルで関連しており、アミロイド沈着物として知られる不溶性線維性タンパク質凝集体の増殖につながるプロセス、 4.神経変性の分子起源とアミロイド形成につながるタンパク質のタンパク質立体構造変化との関連は、しかし、不均一性、一過性、ナノスケールの高いレベルのために、大部分は不明のままである。病理学的凝集体の次元4、5。

過去数十年のタンパク質構造の非常に成功した調査は、X線結晶学、クライオ電子顕微鏡および核磁気共鳴分光法5を含むバルク法の使用に広く基づいている。6,7,8,9.このクラスの技術の中で、赤外線(IR)分光法は、タンパク質8などの生物学的システムの化学的特性を解明するための敏感な分析ツールとして出現した。IR法は、タンパク質の二次的および四次構造変化の定量化を可能にします。さらに、凝集中のタンパク質の複雑な自由エネルギー景観に関与する機械的詳細を顕微鏡レベルでさらに解読するために、複雑にまで広がる化学運動学ツールの開発が大きな進歩を遂げました。アミロイド線維形成5、6、7、10、11、12を含む自己組み立て経路。しかし、バルク分光法は、溶液中に存在する種の異種アンサンブルに関する平均的な情報のみを提供し、特定の顕微鏡ステップに関与しているため、個々の生物物理学的特性の調査を行うナノスケールレベル13、14で挑戦する集約種。

光の回折限界よりも小さいスケールで動作する能力を持ついくつかの顕微鏡検査技術は、過去数十年で出現しています。このクラスの方法には、電子顕微鏡(EM)および原子間力顕微鏡(AFM)が含まれる。走査電子顕微鏡(SEM)と透過電子顕微鏡(TEM)は標本の2次元(2D)画像を提供する一方で、AFMは過去数十年にわたり、3次元(3D)形態を研究するための強力で汎用性の高い技術として登場しました。サブナノメートル分解能13、14、15、16、17、18、19、サンプルのナノ機械的特性と同様に、 20歳,21歳,22歳,23歳,24歳,25名,26歳,27.AFMを介してタンパク質凝集を研究する背後にある根拠は、このアプローチは、溶液13,14,16に存在する個々の種の形態の調査を可能にする、 17,19,20,21,25,27,28,29,30, 31,32,33,34,35,36,37.特に、時間の関数としてサンプルをモニタリングすることにより、AFMは、サンプル内の種の形態の進化の調査を可能にし、アミロイド形成23の経路を追従および可視化することを可能にする。 25,38,39,40,41,42.さらに、AFMは、溶液13、19、30、31に存在する個々の種の断面高さおよび長さなどの構造パラメータの定量を可能にする ,32,33,34,35,36,37,40,43,44歳,45歳,46歳,47歳,48.しかし、形態学のような単一の生物物理学的性質の研究は、多くの場合、異種および複雑な生物学的システムを研究する際に十分ではない。AFM、SEMまたはTEMイメージング法だけでは、ナノスケールでのアミロイド凝集体の異種種の化学的特性を容易に明らかにしない。

この規模での異種生体試料の解析に大きな進歩が見られ、最近では、赤外線ナノ分光法(AFM-IR)24,26のタンパク質凝集分野への応用が進み、 38,42,49,50,51,52.この革新的な方法は、AFM(~1−10nm)の空間分解能とIRの化学分析力の組み合わせを利用します。AFM-IR技術は、IRレーザーによって駆動される光熱誘導共鳴効果の測定と、AFM先端によって調査中のサンプルの熱膨張の測定に基づいています。サンプルは、従来の赤外線分光法24、42、52、53と同様に、全体的な内部反射で上から直接または下からIRレーザーによって照射することができる.IRレーザーは数百キロヘルツ(1−1000 kHz)の順序で典型的な周波数で脈打ち、広いスペクトル範囲、典型的には1000−3300 cm-1の間で調整することができる。レーザー光源は直径約30μmの面積をカバーしますが、AFM-IR技術の空間分解能は、システムの局所的な熱膨張を検出するAFM先端径によって公称的に決定されます。AFM-IRは、IR信号が1−1.5 μmまでの厚さに比例し、得られるIRスペクトルは一般的に対応するFTIR透過スペクトル13、54と一致しているため、生物学的サンプルの研究に適しています。 、55.このため、分光法における確立された分析方法は、化学シフトの研究、バンド形状変化および第2誘導体分析による非畳み込み52の研究など容易に適用することができる。全体的に、AFMの空間分解能とIR分光法の化学認識力を組み合わせることで、AFM-IRはナノスケールでのサンプルの形態的、機械的、化学的特性の広い範囲の同時取得を可能にします。

ここでは、インビトロ蛍光アッセイ、高分解能AFMイメージングおよびナノスケールAFM-IRの組み合わせを利用するタンパク質凝集プロセスの特性評価のためのプロトコルを例示する。この組み合わせアプローチは、タンパク質凝集体によって形成された個々のマイクロ液滴の化学的および構造的特性の研究、液体液タンパク質相分離の研究において、およびナノスケール23、26、38、45、50、53における個々の凝集種の不均一性および生物物理学的特性を調べている 56、57。

Protocol

1. 蛍光プレートリーダーの凝集アッセイ 注:ここで説明するプロトコルは、化学動態によるタンパク質またはペプチドの凝集を研究する方法の一例です。特に、アルツハイマー病58、59の発症および進行に関与するAβ42ペプチドの凝集を研究するために最適化されたプロトコルを記述する。同様のプロトコルは、任意のタンパク質?…

Representative Results

ThT蛍光アッセイによって測定されたAβ42凝集の代表的な時間経過を図1に示す。集約プロセスは、一般的に、ラグ相が最初に観察されるシグモイド曲線によって特徴付けられ、その後、平衡定常状態に達したときに曲線が高原に達する前に急激な成長相が続きます。,58.集約プロセスに関する分子の詳?…

Discussion

このプロトコルの最初の重要なステップは、ステップ1.1および1.2で説明するAβ42溶液の場合のような単量体タンパク質の調製である。オリゴマーまたは凝集種の存在は、凝集運動学58の再現性が悪い可能性があり、AFMでアーティファクトを誘導する可能性があるため、非常に純粋な単量体溶液から集約プロセスを開始することが不可欠です。測定(例えば、フィブリル種は、?…

Divulgations

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

著者らは、スイス国立科学財団(SNF)の財政支援(助成番号P2ELP2_162116とP300P2_171219)、ダーウィンカレッジ、エラスムス+プログラム(助成番号2018-1-LT01-KA103-046719-154000)に感謝します。これらの成果につながる研究は、ERC助成金フィスプロト(契約番号337969)、ニューマン財団(T.P.J.K.)および欧州連合の第7フレームワークプログラム(FP7/2007-2013)の下で欧州研究評議会から資金を受け取っています。ケンブリッジ・センター・フォー・フォールディング・疾患(C.G.、M.V.、T.P.J.K.)

Materials

AFM-IR system Anasys Instruments nanoIR 2 or 3 Systems to measure thermal expansion in contact and resonance mode
Corning 96-well Half Area Black/Clear Bottom Polystyrene NBS Microplate Corning 3881
Corning Microplate Aluminium Sealing Tape Corning 6570
Double Sided Adhesive Discs AGAR Scientific AGG3347N
FLUOstar Omega BMG Labtech 415-101 Platereader
Mica Disc 10mm V1 AGAR Scientific AGF7013
Park NX10 AFM system Park Systems N/A Atomic Force Microscope
Platypus Ultra-Flat Gold Chips Platypus Technologies AU.1000.SWTSG
PPP-NCHR-10 cantilevers Park Systems PPP-NCHR-10
Protein LowBind Tubes, 2.0mL Eppendorf 30108132
Silicon gold coated cantilevers Anasys Instruments PR-EX-nIR2
SPM Specimen Discs 12mm AGAR Scientific AGF7001
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Keywords: Protein AggregatesInfrared NanospectroscopyAtomic Force MicroscopySingle Molecule MethodsBiomolecular ProcessesNano ScaleHeterogeneous SystemsProtein AggregationBiomaterialsDrug DeliveryAFM ParametersAFM ImagingAFM CantileverAFM Laser BeamAFM Deflected BeamAFM OscillationAFM Resonance
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Ruggeri, F. S., Šneideris, T., Chia, S., Vendruscolo, M., Knowles, T. P. J. Characterizing Individual Protein Aggregates by Infrared Nanospectroscopy and Atomic Force Microscopy. J. Vis. Exp. (151), e60108, doi:10.3791/60108 (2019).
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