In vivo beoordeling van alveolaire macrofaag Efferocytose na blootstelling aan ozon
Summary
Dit manuscript beschrijft een protocol om te bepalen of blootstelling aan ozon, een criterium luchtverontreinigende stof, in vivo alveolaire macrofaag-efferocytose belemmert. Dit protocol maakt gebruik van veelgebruikte reagentia en technieken en kan worden aangepast aan meerdere modellen van long letsel om de effecten op alveolaire macrofaag efferocytose te bepalen.
Abstract
Ozon (O3) is een criterium luchtverontreiniging die de incidentie van chronische longziekten vererveert en verhoogt. O3 blootstelling is bekend voor het induceren van pulmonale ontsteking, maar er is weinig bekend over hoe blootstelling processen belangrijk voor de resolutie van ontsteking verandert. Efferocytose is een proces van de afwikkeling, waarbij macrofagen fagocytize apoptotic cellen. Het doel van dit protocol is het meten van alveolaire macrofaag efferocytose na O3-geïnduceerde long letsel en ontsteking. Er zijn verschillende methoden beschreven voor het meten van efferocytose; echter, de meeste vereisen ex vivo manipulaties. In detail beschreven hier is een protocol voor het meten in vivo alveolaire macrofaag efferocytose 24 h na O3 blootstelling, die ex vivo manipulatie van macrofagen vermijdt en dient als een eenvoudige techniek die kan worden gebruikt om nauwkeurig te vertegenwoordigen perturbaties in Dit afwikkelingsproces. Het protocol is een technisch niet-intensieve en relatief goedkope methode waarbij hele lichaam O3 inademing gevolgd door orofaryngeale aspiratie van apoptotic cellen (dat wil zeggen, Jurkat T cellen) terwijl onder algemene anesthesie. Alveolaire macrofaag efferocytose wordt vervolgens gemeten aan de hand van een lichte microscopie van de macrofagen verzameld uit bronchoalveolaire (bal) lavage. Efferocytose wordt uiteindelijk gemeten door berekening van een efferocytische index. Collectief, de beschreven methoden kwantificeren efferocytische activiteit in de longen in vivo terwijl ook dienen voor het analyseren van de negatieve gezondheidseffecten van O3 of andere geïnhaleerde insulten.
Introduction
De Long wordt voortdurend blootgesteld aan milieu-beledigingen, waaronder lucht deeltjes, virussen, bacteriën en oxidanten gassen die leiden tot pulmonale ontstekingen1,2,3. Deze beledigingen kunnen gas uitwisseling in gevaar brengen en induceren onomkeerbaar weefsel letsel4,5. Alveolaire macrofagen, die ongeveer 95% van de immuuncellen in de muriene en menselijke longen in de homeostase vormen, zijn kritische regulatoren van pulmonale ontsteking na milieu-insulten1,2, 3,4,5. Alveolaire macrofagen zijn essentieel tijdens de host verdediging door fagocytizing en elimineren van pathogenen. Onlangs, alveolaire macrofagen is aangetoond dat het bevorderen van weefselhomeostase en de resolutie van ontsteking door efferocytose6,7. Efferocytose is een fagocytisch proces waarbij macrofagen de apoptotische cellen8,9,10overspoelen en elimineren. Efferocytose resulteert ook in de productie van mediatoren (dat wil zeggen, Il-10, TGF-β, PGE2, en stikstofmonoxide) die het proces verder vergroten, resulterend in de resolutie van de ontsteking9,10,11 ,12,16,18. Dit proces is noodzakelijk voor het voorkomen van secundaire necrose en bevordering van weefselhomeostase12,13,14. Verschillende studies hebben een verstoorde efferocytose met verschillende chronische longziekten, waaronder astma, chronische obstructieve longziekte, en idiopathische pulmonale fibrose8,9,15, 16,17.
O3 is een criterium luchtverontreiniging die de incidentie van chronische longziekten19,20,21vererveert en verhoogt. O3 induceert pulmonale ontsteking en letsel en is gekend om de aantasting van alveolaire macrofaag fagocytose van bacteriële pathogenen22,23. Het is echter niet bekend of O3 de alveolaire macrofaag efferocytose schaadt. Onderzoeken van O3-geïnduceerde veranderingen in alveolaire macrofaag efferocytose zal potentiële inzicht geven in hoe blootstelling kan leiden tot chronische longziekte incidentie en exacerbatie. Hieronder beschreven is een eenvoudige methode om alveolaire macrofaag efferocytose in de longen van vrouwelijke muizen te evalueren na blootstelling aan acute O3 .
De beschreven methode bezit verschillende voordelen ten opzichte van andere efferocytose-protocollen die vaak worden gebruikt in het veld door het elimineren van het gebruik van dure fluorescerende kleurstoffen, uitgebreide Flowcytometrie-metingen en ex vivo-manipulatie van alveolaire macrofagen24 ,25. Daarnaast meet dit protocol alveolaire macrofaag efferocytose in de context van de Long microomgeving, die de macrofaag functie kan beïnvloeden.
Protocol
Representative Results
Discussion
Efferocytose is een ontstekingsremmend proces waarbij macrofagen de apoptotische cellen en het puin duidelijk maken en meerdere ontstekingsremmende mediatoren9,10,11,12,16 ,18. Meerdere modellen van efferocytose hebben inzicht gegeven in hoe de macrofaag een kritieke cel is in de resolutie van ontsteking6</…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Deze studie wordt gefinancierd door het Health Effects Institute Walter A. Rosenblith Award en NIEHS R01ES028829 (naar K. M. G). We willen Dr. Dianne Walters (departement fysiologie, ECU) bedanken voor haar hulp bij het verkrijgen van representatieve beelden van alveolaire macrofagen.
Materials
| Annexin V-FITC Kit | Trevigen | 4830-250-K | The TACS Annexin V-FITC Kit allows rapid, specific, and quantitative identification of apoptosis in individual cells when using flow cytometry. |
| BCL2 Jurkat T Cells | ATCC | ATCC CRL-2899 | The BCL2 Jurkat cell line was derived by transfecting human Jurkat T cells with the pSFFV-neo mammalian expression vector containing the human BCL-2 ORF insert and a neomycin-resistant gene. Has been for models of measuring efferocytosis. |
| Countess II Automated Cell Counter | Thermofisher | AMQAX1000 | It is a benchtop assay platform equipped with state-of-the-art optics, full autofocus, and image analysis software for rapid assessment of cells in suspension. Very easy to use. |
| Cytospin 4 Cytocentrifuge | Thermofisher | A78300003 | Provides economical thin-layer preparations from any liquid matrix, especially hypocellular fluids such as bronchoalveolar lavage fluid. |
| Fetal Bovine Serum, qualified, heat inactivated | Thermofisher | 16140071 | Provides Nutrients to cultured cells for them to grow. It is standard for cell culture. |
| Kwik-Diff Reagent 2, Eosin | Thermofisher | 9990706 | Eosin staining that stains cytoplasm. |
| Kwik-Diff Reagent 1, Fixative | Thermofisher | 9990705 | Fixes cells to be stained by H&E. |
| Kwik-Diff Reagent 3, Methylene Blue | Thermofisher | 9990707 | Methylene Blue staining that stains the nucleus. |
| Penicillin-Streptomycin | Sigma/Aldrich | P0781-100ML | Penicillin-Streptomycin is the most commonly used antibiotic solution for culture of mammalian cells. Additionally it is used to maintain sterile conditions during cell culture. |
| RPMI 1640 Medium, GlutaMAX Supplement | Thermofisher | 61870036 | RPMI 1640 Medium (Roswell Park Memorial Institute 1640 Medium) was originally developed to culture human leukemic cells in suspension and as a monolayer. RPMI 1640 medium has since been found suitable for a variety of mammalian cells, including HeLa, Jurkat, MCF-7, PC12, PBMC, astrocytes, and carcinomas. Helps grow Jurkat T cells fast and efficiently. |
| Stratagene UV Stratalinker 1800 UV Crosslinker | Cambridge Scientific | 16659 | The Stratalinker UV crosslinker is designed to induce apoptosis, crosslink DNA or RNA to nylon, nitrocellulose, or nylon-reinforced nitrocellulose membranes. |
| Teledyne T400 ultraviolet light photometer | Teledyne API | T400 | The Model T400 UV Absorption analyzer uses a system based on the Beer-Lambert law for measuring low ranges of ozone in ambient air. |
| Teledyne T703 Ozone calibrator | Teledyne API | T703 | Provides feedback control of the UV lamp intensity, assuring stable ozone output. |
References
- Puttur, F., Gregory, L. G., Lloyd, C. M. Airway macrophages as the guardians of tissue repair in the lung. Immunology and Cell Biology. , (2019).
- Gregoire, M., et al. Impaired efferocytosis and neutrophil extracellular trap clearance by macrophages in ARDS. European Respiratory Journal. 52 (2), (2018).
- Fan, E. K. Y., Fan, J. Regulation of alveolar macrophage death in acute lung inflammation. Respiratory Research. 19 (1), 50 (2018).
- Michlewska, S., McColl, A., Rossi, A. G., Megson, I. L., Dransfield, I. Clearance of dying cells and autoimmunity. Autoimmunity. 40 (4), 267-273 (2007).
- Bhattacharya, J., Westphalen, K. Macrophage-epithelial interactions in pulmonary alveoli. Seminars in Immunopathology. 38 (4), 461-469 (2016).
- Donnelly, L. E., Barnes, P. J. Defective phagocytosis in airways disease. Chest. 141 (4), 1055-1062 (2012).
- Morimoto, K., Janssen, W. J., Terada, M. Defective efferocytosis by alveolar macrophages in IPF patients. Respiratory Medicine. 106 (12), 1800-1803 (2012).
- Vandivier, R. W., et al. Dysfunctional cystic fibrosis transmembrane conductance regulator inhibits phagocytosis of apoptotic cells with proinflammatory consequences. American Journal of Physiology Lung Cellular and Molecular Physiology. 297 (4), L677-L686 (2009).
- Grabiec, A. M., et al. Diminished airway macrophage expression of the Axl receptor tyrosine kinase is associated with defective efferocytosis in asthma. The Journal of Allergy and Clinical Immunology. 140 (4), 1144-1146 (2017).
- Chen, W., Frank, M. E., Jin, W., Wahl, S. M. TGF-beta released by apoptotic T cells contributes to an immunosuppressive milieu. Immunity. 14 (6), 715-725 (2001).
- Gao, Y., Herndon, J. M., Zhang, H., Griffith, T. S., Ferguson, T. A. Antiinflammatory effects of CD95 ligand (FasL)-induced apoptosis. Journal of Experimental Medicine. 188 (5), 887-896 (1998).
- O’Brien, B. A., Fieldus, W. E., Field, C. J., Finegood, D. T. Clearance of apoptotic beta-cells is reduced in neonatal autoimmune diabetes-prone rats. Cell Death and Differentiation. 9 (4), 457-464 (2002).
- Shen, Z. X., et al. Mineralocorticoid Receptor Deficiency in Macrophages Inhibits Atherosclerosis by Affecting Foam Cell Formation and Efferocytosis. Journal of Biological Chemistry. 292 (3), 925-935 (2017).
- Allard, B., Panariti, A., Martin, J. G. Alveolar Macrophages in the Resolution of Inflammation, Tissue Repair, and Tolerance to Infection. Frontiers in Immunology. 9, 1777 (2018).
- Hamon, R., et al. Bushfire smoke is pro-inflammatory and suppresses macrophage phagocytic function. Science Reports. 8 (1), 13424 (2018).
- Angsana, J., Chen, J., Liu, L., Haller, C. A., Chaikof, E. L. Efferocytosis as a regulator of macrophage chemokine receptor expression and polarization. European Journal of Immunology. 46 (7), 1592-1599 (2016).
- Karaji, N., Sattentau, Q. J. Efferocytosis of Pathogen-Infected Cells. Frontiers in Immunology. 8, 1863 (2017).
- Brouckaert, G., et al. Phagocytosis of necrotic cells by macrophages is phosphatidylserine dependent and does not induce inflammatory cytokine production. Molecular Biology of the Cell. 15 (3), 1089-1100 (2004).
- Gonzalez-Guevara, E., et al. Exposure to ozone induces a systemic inflammatory response: possible source of the neurological alterations induced by this gas. Inhalation Toxicology. 26 (8), 485-491 (2014).
- Robertson, S., et al. CD36 mediates endothelial dysfunction downstream of circulating factors induced by O3 exposure. Toxicological Sciences. 134 (2), 304-311 (2013).
- Kilburg-Basnyat, B., et al. Specialized Pro-Resolving Lipid Mediators Regulate Ozone-Induced Pulmonary and Systemic Inflammation. Toxicological Sciences. 163 (2), 466-477 (2018).
- Jakab, G. J., Spannhake, E. W., Canning, B. J., Kleeberger, S. R., Gilmour, M. I. The effects of ozone on immune function. Environ Health Perspect. 103 Suppl 2, 77-89 (1995).
- Gilmour, M. I., Hmieleski, R. R., Stafford, E. A., Jakab, G. J. Suppression and recovery of the alveolar macrophage phagocytic system during continuous exposure to 0.5 ppm ozone. Experimental Lung Research. 17 (3), 547-558 (1991).
- Nayak, D. K., Mendez, O., Bowen, S., Mohanakumar, T. Isolation and In Vitro Culture of Murine and Human Alveolar Macrophages. Journal of Visualized Experiments. 10 (134), (2018).
- Tao, H., et al. Macrophage SR-BI mediates efferocytosis via Src/PI3K/Rac1 signaling and reduces atherosclerotic lesion necrosis. Journal of Lipid Research. 56 (8), 1449-1460 (2015).
- Coe, L. M., et al. FGF-23 is a negative regulator of prenatal and postnatal erythropoiesis. Journal of Biological Chemistry. 289 (14), 9795-9810 (2014).
- Yong, W. K., Abd Malek, S. N. Xanthohumol induces growth inhibition and apoptosis in ca ski human cervical cancer cells. Evidence-Based Complementary and Alternative Medicine. , 921306 (2015).
- Van de Laar, L., et al. Yolk Sac Macrophages, Fetal Liver, and Adult Monocytes Can Colonize an Empty Niche and Develop into Functional Tissue-Resident Macrophages. Immunity. 44 (4), 755-768 (2016).
- Lavin, Y., et al. Tissue-resident macrophage enhancer landscapes are shaped by the local microenvironment. Cell. 159 (6), 1312-1326 (2014).
- Beattie, L., et al. Bone marrow-derived and resident liver macrophages display unique transcriptomic signatures but similar biological functions. Journal of Hepatology. 65 (4), 758-768 (2016).
- Svedberg, F. R., et al. The lung environment controls alveolar macrophage metabolism and responsiveness in type 2 inflammation. Nature Immunology. , (2019).
- Crowther, J. E., et al. Pulmonary surfactant protein a inhibits macrophage reactive oxygen intermediate production in response to stimuli by reducing NADPH oxidase activity. Journal of Immunology. 172 (11), 6866-6874 (2004).
- Silveyra, P., Floros, J. Genetic variant associations of human SP-A and SP-D with acute and chronic lung injury. Frontiers in Bioscience. 17, 407-429 (2012).
- Schagat, T. L., Wofford, J. A., Wright, J. R. Surfactant protein A enhances alveolar macrophage phagocytosis of apoptotic neutrophils. Journal of Immunology. 166 (4), 2727-2733 (2001).
- Gomez Perdiguero, E., et al. Tissue-resident macrophages originate from yolk-sac-derived erythro-myeloid progenitors. Nature. 518 (7540), 547-551 (2015).
- Nebbioso, A., et al. Time-resolved analysis of DNA-protein interactions in living cells by UV laser pulses. Scientific Reports. 7 (1), 11725 (2017).
- Novak, Z., et al. Efficacy of different UV-emitting light sources in the induction of T-cell apoptosis. Photochemistry and Photobiology. 79 (5), 434-439 (2004).
- Park, Y. J., et al. PAI-1 inhibits neutrophil efferocytosis. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 105 (33), 11784-11789 (2008).
- Kleeberger, S. R., Reddy, S., Zhang, L. Y., Jedlicka, A. E. Genetic susceptibility to ozone-induced lung hyperpermeability: role of toll-like receptor 4. American Journal of Respiratory Cell and Molecular Biology. 22 (5), 620-627 (2000).
- Wesselkamper, S. C., Chen, L. C., Kleeberger, S. R., Gordon, T. Genetic variability in the development of pulmonary tolerance to inhaled pollutants in inbred mice. American Journal of Physiology-Lung Cellular and Molecular Physiology. 281 (5), L1200-L1209 (2001).
