Denne protokol viser induktion af et hemogen program i humane Dermal fibroblaster ved tvungen ekspression faktorer GATA2, GFI1B og FOS til at generere hæmatopoietisk stilk og stamceller.
De cellulære og molekylære mekanismer, som er underliggende specifikation af humane hæmatopoietiske stamceller (HSCs), er fortsat undvigende. Strategier til at rekapitulere Human HSC fremkomsten in vitro er forpligtet til at overvinde begrænsninger i at studere denne komplekse udviklingsmæssige proces. Her beskriver vi en protokol til generering af hæmatopoietisk stilk og stamceller fra humane Dermal fibroblaster, som anvender en direkte celle omprogrammering. Disse celler transit gennem en hemogen mellemliggende celle-type, der ligner Endothelial-til-hæmatopoietiske overgang (EHT) karakteristisk for HSC specifikation. Fibroblaster blev omprogrammeret til hæmatogene celler via transduktion med GATA2, GFI1B og FOS transkriptionsfaktorer. Denne kombination af tre faktorer induceret morfologiske ændringer, udtryk for hæmatogen og hæmatopoietiske markører og dynamiske EHT transkriptionelle programmer. Omprogrammerede celler genererer hæmatopoietisk afkom og genbefolker immundefekt mus i tre måneder. Denne protokol kan tilpasses til den mekanistiske dissektion af den menneskelige EHT-proces som eksemplificeret her ved at definere GATA2 mål i de tidlige faser af omprogrammeringen. Således, Human hemogenic omprogrammering giver en enkel og Tractable tilgang til at identificere nye markører og lovgivere af menneskelig HSC fremkomsten. I fremtiden kan trofast induktion af hemogen skæbne i fibroblaster føre til dannelse af patientspecifikke HSCs til transplantation.
Endegyldig hæmatopoietisk stamcelle-og progenitorceller (Hspc’er) opstår i aorta-gonad-mesonephros-regionen (AGM) og placenta fra endotelprækursorer med hæmatogen kapacitet gennem en endotelal-til-hæmatopoietisk overgang (EHT)1, 2. Hemogenic prækursorer (HPs) udtrykker både endotelale og hæmatopoietiske markører, men deres præcise identifikation forbliver flygtige, især i det menneskelige system. Selv om det er en relativt bevaret proces hos pattedyr, er udviklingen af hæmatopoietiske stamceller (HSC) stadig signifikant forskellig mellem mennesker og musemodeller3,4. Der er derfor behov for in vitro -tilgange til at rekapitulere menneskelig HSC-udvikling.
Differentiering af pluripotente stamceller (kvikskranker) til HSCs, selv om lovende, har mødt begrænset succes i løbet af de sidste 20 år, hovedsagelig på grund af de tilgængelige differentierings protokoller, som resulterer i primitive hæmatopoietiske progenitorer med dårlig engraftment evne5,6,7. Alternativt, direkte celle omprogrammering metoder er blevet anvendt til at generere HSPC-lignende celler fra flere celletyper, ved hjælp af transkriptionsfaktorer (TFS)8,9. Især over ekspression af tre TFs, Gata2, Gfi1b og cFos, konverterede mus embryonale fibroblaster i Hspc’er gennem en HP mellemprodukt med en defineret fænotype (Prom1 + SCA-1 + CD34 + CD45-)10. Denne proces lignede EHT, der opstår i embryonet og placenta, under specifikation af definitive hæmatopoiese. Denne fænotype gjorde det muligt at identificere og isolation af en population af HPS i muse placenta, at efter kortsigtede kultur og notch aktivering genereret serielt planteres hscs11.
Hidtil er der ikke blevet etableret nogen fænotype, der skelner mellem humane HSCs fra deres prækursorer, men nogle molekyler er kendt for at være udtrykt i nye HSCs. integrin Alpha 6 (ITGA6 eller CD49f) er stærkt udtrykt i langsigtede genbefolkende HSCs, den mest umodne cellerne i HSC-segmentet12og angiotensin-konverterings enzymet (ACE eller CD143) findes i CD34 negative hæmatopoietiske prækursorer i embryonale bloddannende væv13.
For nylig har vi vist, at menneskelige versioner af de tre TFs, GATA2, FOS og GFI1B omprogrammere humane Dermal fibroblaster (Hdf’er) til HPs med kortvarig engraftment kapacitet14. I de indledende faser af omprogrammering, GATA2 engagerer åben kromatin og rekrutter GFI1B og FOS til at undertrykke fibroblast gener og aktivere endotelale og hæmatopoietiske gener. Inducerede celler højt udtrykt CD49f og ACE, og indeholdt en lille procentdel af celler, der udtrykker HSPC markør CD34. CD9-genet, der udtrykkes i HSCs15 og er vigtigt for HSC homing16, viste sig at være et direkte mål for GATA2 og blandt de mest opregulerede gener i omprogrammerede celler14. CD9 kan derfor udgøre en yderligere markør for HPs af humant endegyldigt hæmatopoiese.
I denne protokol beskriver vi genereringen af HSPC-lignende celler fra humane fibroblaster gennem tvungen ekspression af GATA2, GFI1B og FOS samt en tilpasset metode til kromatin-immunopræcipitation (ChIP)-sekventering (SEQ)-analyse ved begyndelsen af Omprogrammering. TFs blev kodet i en doxycyclin (DOX)-inducerbar lentiviral vektor (pFUW-tetO), der indeholder et tetracyclin-respons element (TRE) og en minimal CMV-promotor, og blev transduceret sammen med en konstitutiv vektor, der indeholdt den omvendte tetracyclin transaktivator protein (pFUW-M2rtTA). Når DOX (analog af tetracyclin) tilsættes efter transduktion, binder det sig til rtTA-proteinet, som interagerer med TRE, der tillader TF-transkriptionen (tet-on-systemet). Proceduren kræver 25 dage at fuldføre. For ChIP-SEQ-eksperimenter blev HDFs transduceret med mærkede versioner af GATA2 (pFUW-tetO-3xFLAG-GATA2) og GFI1B (pLV-tetO-HA-GFI1B), plus pFUW-tetO-FOS-og TF-bindingssteder blev analyseret to dage efter DOX-tilskud.
I sidste ende, hemogenic omprogrammering af humane fibroblaster giver en in vitro Tractable system til at studere de mekanismer underliggende menneskelig udviklingsmæssige hæmatopoiese og en potentiel kilde til patientspecifikke Hspc’er til fremtidig klinisk anvendelse.
I denne artikel beskrives en metode til at generere hæmatopoietiske stamceller direkte fra humane fibroblaster, som går gennem en HP-celle mellemprodukt, på samme måde som definitive HSCs14.
Pool-produktion af lentiviral partikler kodning GATA2, GFI1B og FOS blev foretrukket frem for individuel produktion, da der i vores hænder det resulterer i højere omprogrammering effektivitetsgevinster (ikke-offentliggjorte data). Som medlemmer af Retroviridae -familien indeholder lentivira normalt to eksemplarer af positiv enkeltstrenget RNA19. Den forøgede omprogrammering effektivitet kan skyldes emballering af to forskellige transgener i samme lentiviral partikel, hvilket resulterer i øget antal celler Co-transduced med de tre transkriptionsfaktorer. For at sikre, at denne protokol bliver en succes, er det nødvendigt at overføre Hdf’er med tilstrækkelig mængde virus afhængigt af celle passagen for at opnå en optimal balance mellem omprogrammering af effektivitet og cellelevedygtighed, som anbefalet i trin 4,6. Desuden kan friske ikke-koncentrerede vira anvendes. Det anbefales at transduce celler med 0,5-3 mL 3TFs pool og M2rtTA. Også, celletæthed bør justeres i henhold til ansøgningen. 150 000 HDFs pr. 6-brønd plade (trin 4,4) gav den optimale tæthed til at udføre FACS, transplantation og flow cytometri analyse af omprogrammerede celler. For spån-SEQ-eksperimenter var der behov for flere celler fra begyndelsen (trin 5,1). Det er vigtigt at kontrollere celler regelmæssigt for morfologiske ændringer og erstatte hæmatopoietisk medium to gange om ugen for at støtte fremkomsten af inducerede hæmatopoietiske celler. Tilsætning af hæmatopoietiske cytokiner eller co-kultur i feeder lag kan øge omprogrammering effektivitet.
Med denne metode kan vi identificere nye hæmatopoietiske markører, der er dynamisk udtrykt under hæmatogen omprogrammering. CD9, som blev påvist at være opreguleret i omprogrammerede celler på det transkriptionelle niveau14, udtrykkes hurtigt ved cellens overflade i de indledende faser af omprogrammeringen sammen med CD49F og CD143 og tjener som en ny markør for humane HSC-prækursorer. Vi viser også, at ITGA6 og Ace er direkte mål for GATA2 i de indledende stadier af hæmatogen omprogrammering, foruden CD9 og CD3414, hvilket giver en direkte mekanistisk forbindelse mellem humane hæmatogene prækursorer fænotype og GATA2.
En fordel ved dette system ligger i brugen af relativt homogene fibroblast kulturer. Mens kvikskranker er let udvides og vedligeholdes in vitro, differentierings protokoller genererer heterogene populationer, der omfatter hæmatopoietiske progenitorer, som forankret dårligt5,6,7. Desuden er der risiko for tumor ved Trans plantering af PSC-afledte hspc’er, da udifferentierede kvikskranker stadig kan forblive i kulturen selv efter anvendelse af differentierings protokoller. Alternativt til fibroblaster, direkte omprogrammering til HSCs er blevet anvendt på blod-engagerede stamceller20 og endotelcellerne21. Men begyndende med blod-begrænset stamcelle celler hindrer terapeutisk anvendelse af de resulterende HSCs, hvis patienten bærer mutationer, der påvirker stammen/stamfader hæmatopoietisk population22. I tilfælde af endotelceller, disse er vanskeligere at opnå i forhold til fibroblaster, og udgør en meget heterogen cellepopulation med hensyn til fænotype, funktion og struktur, som er organ-afhængige23. Andre undersøgelser har formået at omprogrammere mus fibroblaster i engraftable hæmatopoietiske stamceller24,25 endnu, indtil videre ingen anden protokol beskriver generering af HSPC-lignende cellerne fra humane fibroblaster.
Denne tilgang, kombineret med farmakologisk hæmning, gen knock-out, eller knock-down tilladelser til at definere individuelle eller kombination af faktorer, der er nødvendige for at direkte fremkalde menneskelige HSCs. anvende højeffektive screeningsmetoder baseret på nylige CRISPR-Cas9 teknologier i HDFs forud for omprogrammering, repræsenterer en spændende bestræbelse for at definere nye regulatorer af menneskelig definitiv hæmatopoiese. I fremtiden, omprogrammering ikke-blod relaterede menneskelige celletyper såsom fibroblaster vil tjene som en platform til at generere sunde patient-skræddersyede hæmatopoietiske stamceller til kliniske anvendelser.
The authors have nothing to disclose.
Knut og Alice Wallenberg Foundation, det medicinske fakultet ved Lunds Universitet og Region Skåne er anerkendt for generøs økonomisk støtte. Dette arbejde blev støttet af en bevilling fra Olle Engkvists stiftelse (194-0694 til Filipe Pereira) og ph. d.-stipendier fra Fundação para a Ciência e tecnologia (PTDC/BIM-MED/0075/2014 til Filipe Pereira og SFRH/BD/135725/2018 og SFRH/BD/51968/2012 til Rita Alves og Andreia Gomes). Denne undersøgelse blev også støttet af midler fra NIH og NYSTEM (1R01HL119404 og C32597GG til Kateri A. Moore).
0.45 μm low-protein binding filter, 150 mL Bottle Top Vacuum Filter | Corning | #430625 | |
2-Mercaptoethanol | Sigma-Aldrich | #M6250 | |
Alexa Fluor 488 anti-human CD34 clone 581 | BioLegend | #343518 | |
BD Pharmingen APC Mouse Anti-Human Angiotensin Converting Enzyme (CD143) clone BB9 | BD Biosciences | #557929 | |
BES buffered saline | Sigma-Aldrich | #14280 | |
Calcium chloride (CaCl2) | Sigma-Aldrich | #449709 | |
Centrifugal filter unit, Amicon Ultra-15 Centrifugal Filter Unit | Sigma-Aldrich | #UFC903096 | |
Dissociation solution, TrypLE Express Enzyme (1X) no phenol red | Gibco | #12604-021 | |
Doxycycline hyclate (DOX) | Sigma-Aldrich | #D9891 | |
eBioscience CD49f (Integrin alpha 6) Monoclonal Antibody (eBioGoH3 (GoH3)), PE-Cyanine7 | Invitrogen | #25-0495-82 | |
FUW-M2rtTA | Addgene | #20342 | |
Gelatin from Porcine Skin Type A | Sigma-Aldrich | #G1890 | |
Gibco L-Glutamine (200 mM) | ThermoFisher Scientific | #25030-024 | |
Gibco MEM Non-Essential Amino Acids Solution (100X) | ThermoFisher Scientific | #11140-035 | |
Hematopoietic medium, MyeloCult H5100 | STEMCELL Technologies | #05150 | |
Hexadimethrine bromide (polybrene) | Sigma-Aldrich | #H9268 | |
Human Dermal Fibroblasts (HDFs) | ScienCell | #2320 | |
HyClone Dulbecco's Modified Eagles Medium (DMEM) | GE Healthcare | #SH30243.01 | |
HyClone Fetal Bovine Serum (FBS) | GE Healthcare | #SV30160.03 | |
HyClone Penicillin Streptomycin 100X Solution (Pen/Strep) | GE Healthcare | #SV30010 | |
HyClone Phosphate Buffered Saline solution (PBS) | GE Healthcare | #SH30256.01 | |
Hydrocortisone | STEMCELL Technologies | #7904 | |
Mouse serum | Sigma-Aldrich | #M5905 | |
PE anti-human CD9 Antibody clone HI9a | BioLegend | #312105 | |
pFUW-tetO-3xFLAG-GATA2 | Addgene | #125600 | |
pFUW-tetO-FOS | Addgene | #125598 | |
pFUW-tetO-GATA2 | Addgene | #125028 | |
pFUW-tetO-GFI1B | Addgene | #125597 | |
pLV-tetO-HA-GFI1B | Addgene | #125599 | |
pMD2.G | Addgene | #12259 | |
psPAX2 | Addgene | #12260 |