इस प्रोटोकॉल प्रतिलेखन कारकों GATA2, GFI1B और FOS hematopoietic स्टेम और संतति कोशिकाओं उत्पन्न करने के लिए लागू अभिव्यक्ति द्वारा मानव dermal फाइब्रोब्लास्ट्स में एक हेमोजेनिक कार्यक्रम के प्रेरण को दर्शाता है.
मानव हेमेटोपोएटिक स्टेम सेल (एचएससी) के विनिर्देश अंतर्निहित सेलुलर और आणविक तंत्र मायावी बने हुए हैं। इस जटिल विकास प्रक्रिया के अध्ययन में सीमाओं को पार करने के लिए इन विट्रो में मानव एचएससी उद्भव को पुन: लागू करने के लिए रणनीतियाँ आवश्यक हैं। यहाँ, हम एक सीधा सेल reprogramming दृष्टिकोण को रोजगार मानव dermal फाइब्रोब्लास्ट्स से hematopoietic स्टेम और संतति की तरह कोशिकाओं उत्पन्न करने के लिए एक प्रोटोकॉल का वर्णन. इन कोशिकाओं को एक हेमजेनिक मध्यवर्ती सेल प्रकार के माध्यम से पारगमन, endothelial-to-hematopoietic संक्रमण (EHT) HSC विनिर्देश की विशेषता के समान. Fibroblasts GATA2, GFI1B और FOS प्रतिलेखन कारकों के साथ transduction के माध्यम से हेमोजेनिक कोशिकाओं के लिए reprogrammed थे. तीन कारकों प्रेरित आकृतिक परिवर्तन, हेमेजेनिक और hematopoietic मार्करों और गतिशील EHT प्रतिलेखन कार्यक्रमों की अभिव्यक्ति का यह संयोजन. पुनर्प्रोग्रामित कोशिकाएं हेमेटोपोएटिक संतति उत्पन्न करती हैं और तीन महीने के लिए इम्यूनोन्यूमेसुविधा वाले चूहों को फिर से लोकप्रिय करती हैं। इस प्रोटोकॉल reprogramming के प्रारंभिक चरणों के दौरान GATA2 लक्ष्यों को परिभाषित करके यहाँ उदाहरण के रूप में मानव EHT प्रक्रिया के मशीनी विच्छेदन की दिशा में अनुकूलित किया जा सकता है. इस प्रकार, मानव हेमोजेनिक reprogramming उपन्यास मार्करों और मानव एचएससी उद्भव के नियामकों की पहचान करने के लिए एक सरल और पथ्य दृष्टिकोण प्रदान करता है. भविष्य में, फाइब्रोब्लास्ट्स में हेमोजेनिक भाग्य के वफादार प्रेरण प्रत्यारोपण के लिए रोगी-विशिष्ट एचएससी की पीढ़ी के लिए नेतृत्व कर सकते हैं।
निश्चित हीमैटोपोएटिक स्टेम और संतति कोशिकाएं (एचपीएससी) महाधमनी-गोनाड-मेसोनफ्रोस (एजीएम) क्षेत्र में उभरती हैं और हेमोजेनिक क्षमता के साथ एंडोथेलियल अग्रदूतों से प्लेसेंटा, एक एंडोथेलियल-टू-हेमेटोपोइटिक संक्रमण (ईएचटी)1, 2. हेमोजेनिक अग्रदूतों (एचपीएस) दोनों endothelial और hematopoietic मार्करों व्यक्त करते हैं, लेकिन उनकी सटीक पहचान मायावी बनी हुई है, विशेष रूप से मानव प्रणाली में. स्तनधारियों में अपेक्षाकृत संरक्षित प्रक्रिया होने के बावजूद, हेमेटोपोएटिक स्टेम सेल (एचएससी) विकास अभी भी मनुष्यों और माउस मॉडल3,4के बीच काफी अलग है। इसलिए, मानव एचएससी विकास को फिर से दोहराने के लिए इन विट्रो दृष्टिकोणों की आवश्यकता है।
एचएससी के लिए pluripotent स्टेम सेल (पीएससी) के भेदभाव, हालांकि आशाजनक, पिछले 20 वर्षों में सीमित सफलता मिली है, ज्यादातर उपलब्ध भेदभाव प्रोटोकॉल के कारण, जो गरीब engraftment के साथ आदिम hematopoietic जनक में परिणाम क्षमता5,6,7. वैकल्पिक रूप से, प्रत्यक्ष सेल reprogramming के तरीके कई सेल प्रकार से HSPC की तरह कोशिकाओं को उत्पन्न करने के लिए लागू किया गया है, प्रतिलेखन कारकों का उपयोग (TFs)8,9. विशेष रूप से, तीन TFs, Gata2, Gfi1b और cFos के overexpression, एक परिभाषित phenotype के साथ एक HP मध्यवर्ती के माध्यम से HSPCs में परिवर्तित माउस भ्रूण फाइब्रोब्लास्ट्स (प्रोम1 + Sca-1 + CD34+CD45-)10. यह प्रक्रिया निश्चित हेमेटोपोइसिस के विनिर्देशन के दौरान भ्रूण और प्लेसेंटा में होने वाली EHT के समान थी। इस phenotype माउस प्लेसेंटा में HPs की आबादी की पहचान और अलगाव सक्षम है कि अल्पकालिक संस्कृति और पायदान सक्रियण के बाद क्रमिक प्रत्यारोपण एचएससी11उत्पन्न .
अब तक, कोई phenotype स्थापित किया गया है कि उनके अग्रदूतों से मानव HSCs अलग है, लेकिन कुछ अणुओं उभरते HSCs में व्यक्त किया जा करने के लिए जाना जाता है. Integrin alpha6 (ITGA6 या CD49f) अत्यधिक लंबी अवधि में व्यक्त किया जाता है HSCs repopulating, सबसे अपरिपक्व एचएससी कम्पार्टमेंट12में कोशिकाओं , और एंजियोटेन्सिन-रूपांतरण एंजाइम (ACE या CD143) भ्रूण रक्त बनाने के ऊतकों में CD34 नकारात्मक hematopoietic अग्रदूतों में मौजूद है13.
हाल ही में, हम तीन TFs, GATA2, FOS और GFI1B reprogram मानव dermal फाइब्रोब्लास्ट्स (HDFs) के मानव संस्करणों अल्पकालिक engraftment क्षमता14के साथ HPs में दिखा दिया है. reprogramming के प्रारंभिक चरणों में, GATA2 खुला chromatin संलग्न है और फाइब्रोब्लास्ट जीन को दबाने और endothelial और hematopoietic जीन को सक्रिय करने के लिए GFI1B और FOS भर्ती करता है. प्रेरित कोशिकाओं अत्यधिक CD49f और ऐस व्यक्त की है, और HSPC मार्कर CD34 व्यक्त कोशिकाओं का एक छोटा सा प्रतिशत निहित. CD9 जीन, जो HSCs15 में व्यक्त किया जाता है और HSC homing16के लिए महत्वपूर्ण है, GATA2 का एक सीधा लक्ष्य और reprogrammed कोशिकाओं14में सबसे ऊपर विनियमित जीन के बीच दिखाया गया था. CD9 इसलिए मानव निश्चित hematopois के HPs के लिए एक अतिरिक्त मार्कर का गठन हो सकता है.
इस प्रोटोकॉल में, हम GATA2, GFI1B और FOS के लागू अभिव्यक्ति के माध्यम से मानव फाइब्रोब्लास्ट्स से HSPC की तरह कोशिकाओं की पीढ़ी का वर्णन है, साथ ही क्रोमैटिन इम्यूनोप्रीसेप्शन के लिए एक अनुकूलित विधि (ChIP)-सेक्शन (सेक) विश्लेषण की शुरुआत में फिर से प्रोग्राम. TFs एक doxycycline (DOX) में एनकोडेड lentiviral वेक्टर (pFUW-tetO) है कि एक टेट्रासाइक्लिन प्रतिक्रिया तत्व (TRE) और एक न्यूनतम CMV प्रमोटर शामिल हैं, और एक साथ एक संरचक वेक्टर रिवर्स टेट्रासाइक्लिन युक्त ट्रांसड्यूस वेक्टर के साथ transduced थे transactivator प्रोटीन (PFUW-M2rtTA). जब DOX (टेट्रासाइक्लिन के अनुरूप) transduction के बाद जोड़ा जाता है, यह RTTA प्रोटीन जो टीआरई टीएफ प्रतिलेखन (टेट-ऑन सिस्टम) की अनुमति के साथ सूचना का आदान-देना करने के लिए बांधता है। प्रक्रिया को पूरा करने के लिए 25 दिनों की आवश्यकता है। ChIP-सेक प्रयोगों के लिए, HDFs GATA2 के टैग किए गए संस्करणों के साथ transduced थे (pFUW-tetO-3xFLAG-GATA2) और GFI1B (PLV-tetO-HA-GFI1B), प्लस pFUW-tetO-FOS और TF बाध्यकारी साइटों DOX पूरकता के बाद दो दिन विश्लेषण किया गया.
अंत में, मानव फाइब्रोब्लास्ट्स के हेमोजेनिक reprogramming मानव विकास hematopois अंतर्निहित तंत्र और भविष्य के नैदानिक आवेदन के लिए रोगी-विशिष्ट HSPCs के एक संभावित स्रोत का अध्ययन करने के लिए एक इनट्रो पथ्य प्रणाली प्रदान करता है।
इस लेख में, एक विधि मानव फाइब्रोब्लास्ट्स से सीधे hematopoietic जनक कोशिकाओं उत्पन्न करने के लिए वर्णित है, जो एक HP सेल मध्यवर्ती के माध्यम से जाना, इसी तरह निश्चित HSCs14के लिए.
गैटा2, जीएफआई1बी और एफओएस को व्यक्तिगत उत्पादन पर पसंद किया गया था, क्योंकि हमारे हाथों में यह उच्च reprogramming क्षमता (अप्रकाशित डेटा) में परिणाम के पूल-उत्पादन। Retroviride परिवार के सदस्य के रूप में Lentiviruses, आम तौर पर सकारात्मक एकल फैला आरएनए19की दो प्रतियां होते हैं। वृद्धि हुई reprogramming दक्षता एक ही lentiviral कण में दो अलग transgenes की पैकेजिंग के कारण हो सकता है, तीन प्रतिलेखन कारकों के साथ सह transduced कोशिकाओं की संख्या में वृद्धि हुई है जिसके परिणामस्वरूप. इस प्रोटोकॉल की सफलता सुनिश्चित करने के लिए, यह सेल मार्ग के आधार पर वायरस की पर्याप्त राशि के साथ HDFs स्थानांतरित करने के लिए आवश्यक है reprogramming दक्षता और सेल व्यवहार्यता के बीच एक इष्टतम संतुलन प्राप्त करने के लिए, के रूप में चरण 4.6 में सिफारिश की. इसके अलावा, ताजा गैर केंद्रित वायरस इस्तेमाल किया जा सकता है. यह 3TFs पूल और M2rtTA के 0.5-3 एमएल के साथ कोशिकाओं को स्थानांतरित करने के लिए सिफारिश की है. इसके अलावा, सेल घनत्व आवेदन के अनुसार समायोजित किया जाना चाहिए। 6-वेल प्लेट (चरण 4.4) प्रति 150 000 HDFs ने पुनप्रोग्रामित कोशिकाओं के FACS, ट्रांसप्लांटेशन और प्रवाह साइटोमेट्री विश्लेषण करने के लिए इष्टतम घनत्व प्रदान किया। ChIP-सेक प्रयोगों के लिए, और अधिक कोशिकाओं को शुरू से आवश्यक थे (चरण 5.1). यह रूपात्मक परिवर्तन के लिए नियमित रूप से कोशिकाओं की जांच करने के लिए महत्वपूर्ण है और प्रेरित hematopoietic कोशिकाओं के उद्भव का समर्थन करने के लिए सप्ताह में दो बार हेमेटोपोएटिक माध्यम की जगह। फीडर परतों में हेमेटोपोएटिक साइटोकिन्स या सह-संस्कृति के अलावा री-प्रोग्रामिंग दक्षता में वृद्धि हो सकती है।
इस विधि के साथ, हम नए hematopoietic मार्करों है कि गतिशील hemogenic reprogramming के दौरान व्यक्त कर रहे हैं की पहचान कर सकते हैं. CD9, जो अप करने के लिए दिखाया गया था प्रतिलिपि स्तर पर reprogrammed कोशिकाओं में विनियमित14,तेजी से CD49f और CD143 के साथ reprogramming के प्रारंभिक चरणों में सेल सतह पर व्यक्त की है, मानव HSC अग्रदूतों के एक उपन्यास मार्कर के रूप में सेवा. हम यह भी पता चलता है कि ITGA6 और ऐस HEmogenic reprogramming के प्रारंभिक चरणों के दौरान GATA2 के प्रत्यक्ष लक्ष्य हैं, CD9 और CD3414के अलावा, मानव हेमोजेनिक के बीच एक सीधा मशीनी लिंक प्रदान अग्रदूत फीनोटाइप और GATA2.
इस प्रणाली का एक लाभ अपेक्षाकृत सजातीय फाइब्रोब्लास्ट संस्कृतियों के उपयोग में रहता है. जबकि पीएससी का आसानीसे विस्तार किया जाता है और इन का इन का इन का इन का विस्तार किया जाता है , वहीं विभेदकारी प्रोटोकॉल विषम जनसंख्या उत्पन्न करते हैं जिनमें हेमाटोपोएटिक संतति शामिल होती है , जो खराब5,6,7को घेरती है . इसके अलावा, पीएससी व्युत्पन्न HSPCs प्रत्यारोपण करते समय ट्यूमरीजनन का खतरा है, क्योंकि अलग-अलग पीएससी अभी भी भेदभाव प्रोटोकॉल को रोजगार देने के बाद भी संस्कृति में रह सकते हैं। फाइब्रोब्लास्ट्स के लिए वैकल्पिक रूप से, एचएससी के लिए सीधे reprogramming रक्त प्रतिबद्ध संतति20 और endothelial कोशिकाओं21के लिए लागू किया गया है। हालांकि, रक्त-प्रतिबंधित संतति कोशिकाओं के साथ शुरू करने से परिणामी एचएससी के चिकित्सीय अनुप्रयोग में बाधा आती है यदि रोगी उत्परिवर्तनों को वहन करता है जो स्टेम/प्रोजेक्टिव हेमेटोपोएटिक जनसंख्या को प्रभावित करताहै। एंडोथेलियल कोशिकाओं के मामले में, फाइब्रोब्लास्ट्स की तुलना में इन्हें प्राप्त करना अधिक कठिन होता है, और फीनोटाइप, फलन और संरचना के संदर्भ में एक बहुत विषम कोशिका जनसंख्या का गठन होता है, जो अंग-निर्भर23हैं। अन्य अध्ययनों में माउस फाइब्रोब्लास्ट्स engraftable hematopoietic संतति24,25 अभी तक, अभी तक, कोई अन्य प्रोटोकॉल मानव फाइब्रोब्लास्ट से HSPC की तरह कोशिकाओं की पीढ़ी का वर्णन में reprogramming में सफल रहा है.
यह दृष्टिकोण, औषधीय अवरोध, जीन नॉक-आउट, या नॉक-डाउन परमिट के साथ मिलकर व्यक्तिगत या कारकों के संयोजन को परिभाषित करने के लिए जो सीधे मानव एचएससी को प्रेरित करने के लिए आवश्यक हैं। हाल के आधार पर उच्च दक्षता स्क्रीनिंग के तरीके को रोजगार CRISPR-Cas9 प्रौद्योगिकियों HDFs में reprogramming से पहले, मानव निश्चित hematopoiesis के उपन्यास नियामकों को परिभाषित करने के लिए एक रोमांचक प्रयास का प्रतिनिधित्व करता है. भविष्य में, इस तरह के फाइब्रोब्लास्ट्स के रूप में गैर रक्त से संबंधित मानव सेल प्रकार reprogramming नैदानिक अनुप्रयोगों के लिए स्वस्थ रोगी-पुच्छी hematopoietic संतान कोशिकाओं उत्पन्न करने के लिए एक मंच के रूप में काम करेंगे।
The authors have nothing to disclose.
Knut और ऐलिस Wallenberg फाउंडेशन, Lund विश्वविद्यालय और क्षेत्र Skne में चिकित्सा संकाय उदार वित्तीय सहायता के लिए स्वीकार कर रहे हैं. इस काम से ओले Engkvists Stiftelse (194-0694 से Filipe Pereira के लिए) और फंडाज़ो पैरा एक Ciencia ई Tecnologia (PTDC/BIM-MED/0075/2014 से Filipe Pereira के लिए पीएचडी छात्रवृत्ति) से एक अनुदान द्वारा समर्थित किया गया था, और SFRH/BD/135725/2018 और SFRH/BD/51968/2012 रीता Alves को और आंद्रेई गोम्स) इस अध्ययन में भी NIH और NYSTEM (1R01HL119404 और C32597GG से Kateri ए मूर) से धन द्वारा समर्थित किया गया था.
0.45 μm low-protein binding filter, 150 mL Bottle Top Vacuum Filter | Corning | #430625 | |
2-Mercaptoethanol | Sigma-Aldrich | #M6250 | |
Alexa Fluor 488 anti-human CD34 clone 581 | BioLegend | #343518 | |
BD Pharmingen APC Mouse Anti-Human Angiotensin Converting Enzyme (CD143) clone BB9 | BD Biosciences | #557929 | |
BES buffered saline | Sigma-Aldrich | #14280 | |
Calcium chloride (CaCl2) | Sigma-Aldrich | #449709 | |
Centrifugal filter unit, Amicon Ultra-15 Centrifugal Filter Unit | Sigma-Aldrich | #UFC903096 | |
Dissociation solution, TrypLE Express Enzyme (1X) no phenol red | Gibco | #12604-021 | |
Doxycycline hyclate (DOX) | Sigma-Aldrich | #D9891 | |
eBioscience CD49f (Integrin alpha 6) Monoclonal Antibody (eBioGoH3 (GoH3)), PE-Cyanine7 | Invitrogen | #25-0495-82 | |
FUW-M2rtTA | Addgene | #20342 | |
Gelatin from Porcine Skin Type A | Sigma-Aldrich | #G1890 | |
Gibco L-Glutamine (200 mM) | ThermoFisher Scientific | #25030-024 | |
Gibco MEM Non-Essential Amino Acids Solution (100X) | ThermoFisher Scientific | #11140-035 | |
Hematopoietic medium, MyeloCult H5100 | STEMCELL Technologies | #05150 | |
Hexadimethrine bromide (polybrene) | Sigma-Aldrich | #H9268 | |
Human Dermal Fibroblasts (HDFs) | ScienCell | #2320 | |
HyClone Dulbecco's Modified Eagles Medium (DMEM) | GE Healthcare | #SH30243.01 | |
HyClone Fetal Bovine Serum (FBS) | GE Healthcare | #SV30160.03 | |
HyClone Penicillin Streptomycin 100X Solution (Pen/Strep) | GE Healthcare | #SV30010 | |
HyClone Phosphate Buffered Saline solution (PBS) | GE Healthcare | #SH30256.01 | |
Hydrocortisone | STEMCELL Technologies | #7904 | |
Mouse serum | Sigma-Aldrich | #M5905 | |
PE anti-human CD9 Antibody clone HI9a | BioLegend | #312105 | |
pFUW-tetO-3xFLAG-GATA2 | Addgene | #125600 | |
pFUW-tetO-FOS | Addgene | #125598 | |
pFUW-tetO-GATA2 | Addgene | #125028 | |
pFUW-tetO-GFI1B | Addgene | #125597 | |
pLV-tetO-HA-GFI1B | Addgene | #125599 | |
pMD2.G | Addgene | #12259 | |
psPAX2 | Addgene | #12260 |