वर्तमान रिपोर्ट में माइक्रोग्लिया या रक्त मैक्रोफेज से एक्सट्रासेलुलर वेसिकल (ईवी) अलगाव के लिए कालक्रम आवश्यकताओं पर प्रकाश डाला गया है। माइक्रोग्लिया-व्युत्पन्न ईवीएस का मूल्यांकन न्यूराइट आउटग्रोथ के नियामकों के रूप में किया गया जबकि रक्त मैक्रोफेज-व्युत्पन्न ईवीएस का अध्ययन इन विट्रो assays में C6 ग्लियोमा सेल आक्रमण के नियंत्रण में किया गया था । लक्ष्य विशिष्ट माइक्रोवातावरण में प्रतिरक्षा मध्यस्थों के रूप में इन ईवी कार्यों को बेहतर ढंग से समझना है।
केंद्रीय तंत्रिका तंत्र (सीएनएस) की न्यूरोभड़काऊ स्थिति शारीरिक और रोग की स्थितियों में महत्वपूर्ण भूमिका निभाती है। माइक्रोग्लिया, मस्तिष्क में निवासी प्रतिरक्षा कोशिकाएं, और कभी-कभी घुसपैठ करने वाली अस्थि मज्जा-व्युत्पन्न मैक्रोफेज (बीएमडीएम), सीएनएस में उनके माइक्रोएनवायरमेंट के भड़काऊ प्रोफ़ाइल को विनियमित करती हैं। अब यह स्वीकार किया जाता है कि प्रतिरक्षा कोशिकाओं से बाह्य वेसिकल (ईवी) आबादी प्रतिरक्षा मध्यस्थों के रूप में कार्य करती है। इस प्रकार, उनके संग्रह और अलगाव उनकी सामग्री की पहचान करने के लिए महत्वपूर्ण हैं, लेकिन प्राप्तकर्ता कोशिकाओं पर उनके जैविक प्रभावों का मूल्यांकन भी करते हैं। वर्तमान डेटा अल्ट्रासेन्ट्रियूजन और आकार-बहिष्कार क्रोमेटोग्राफी (एसईसी) चरणों सहित माइक्रोग्लिया कोशिकाओं या रक्त मैक्रोफेज से ईवी अलगाव के लिए कालक्रम आवश्यकताओं को उजागर करता है। एक गैर-लक्षित प्रोटेओमिक विश्लेषण ने ईवी मार्कर के रूप में प्रोटीन हस्ताक्षरों के सत्यापन की अनुमति दी और जैविक रूप से सक्रिय ईवी सामग्री की विशेषता बताई। न्यूराइट आउटग्रोथ में प्रतिरक्षा मध्यस्थों के रूप में उनके महत्व का आकलन करने के लिए माइक्रोग्लिया-व्युत्पन्न ईवीएस का उपयोग न्यूरॉन्स की प्राथमिक संस्कृति पर भी कार्यात्मक रूप से किया गया था। परिणामों से पता चला है कि माइक्रोग्लिया-व्युत्पन्न ईवीएस विट्रो में न्यूराइट आउटग्रोथ को सुविधाजनक बनाने में योगदान देते हैं । समानांतर में, रक्त मैक्रोफेज-व्युत्पन्न ईवीएस का उपयोग सी6 ग्लियोमा कोशिकाओं की स्फेरॉइड संस्कृतियों में प्रतिरक्षा मध्यस्थों के रूप में कार्यात्मक रूप से किया जाता था, परिणाम दिखाते हैं कि ये ईवीएस विट्रो में ग्लियोमा सेल आक्रमण को नियंत्रित करते हैं। इस रिपोर्ट में ईवी-मध्यस्थता प्रतिरक्षा कोशिका कार्यों का मूल्यांकन करने की संभावना पर प्रकाश डाला गया है, लेकिन इस तरह के संचार के आणविक ठिकानों को भी समझते हैं । यह गूढ़ प्राकृतिक वेसिकल्स के उपयोग को बढ़ावा दे सकता है और/या सीएनएस विकृतियों के सूक्ष्म वातावरण में प्रतिरक्षा गुणों की नकल करने के लिए चिकित्सीय वेसिकल्स की इन विट्रो तैयारी ।
कई न्यूरोपैथोलॉजी न्यूरो-भड़काऊ स्थिति से संबंधित हैं जो एक जटिल तंत्र है जिसे तेजी से माना जाता है, लेकिन फिर भी खराब समझा जाता है क्योंकि प्रतिरक्षा प्रक्रियाएं विविध हैं और कोशिका पर्यावरण पर निर्भर करती हैं। दरअसल, सीएनएस विकारों में व्यवस्थित रूप से एक ही सक्रियण संकेतऔर प्रतिरक्षा कोशिका आबादी शामिल नहीं है और इस प्रकार समर्थक या विरोधी भड़काऊ प्रतिक्रियाओं का मूल्यांकन रोगों के कारणों या परिणामों के रूप में करना मुश्किल है। “माइक्रोग्लिया” नामक मस्तिष्क निवासी मैक्रोफेज तंत्रिका और प्रतिरक्षा प्रणाली1के बीच इंटरफेस पर दिखाई देते हैं। माइक्रोग्लिया में एक माइलॉयड मूल होता है और मस्तिष्क को उपनिवेश बनाने के लिए आदिम हेमेटोपोइसिस के दौरान जर्दी थैली से प्राप्त होते हैं, जबकि परिधीय मैक्रोफेज निश्चित हेमेटोपोइसिस के दौरान भ्रूण यकृत से परिधीय मैक्रोफेज2बनने के लिए प्राप्त होते हैं। माइक्रोग्लिया कोशिकाएं न्यूरॉन्स और न्यूरॉन-व्युत्पन्न ग्लियल कोशिकाओं जैसे एस्ट्रोसाइट्स और ओलिगोडेन्ट्रोसाइट्स3के साथ संवाद करती हैं। हाल के कई अध्ययनों से पता चला है कि माइक्रोग्लिया सीएनएस विकास और वयस्क ऊतक होमोस्टोसिस के दौरान न्यूरोनल प्लास्टिसिटी में शामिल हैं, और न्यूरोडीजेनेरेटिव बीमारियोंसेजुड़े भड़काऊ राज्य में भी4,5। अन्यथा, रक्त मस्तिष्क बाधा की अखंडता अन्य सीएनएस विकृतियों में समझौता किया जा सकता है। प्रतिरक्षा प्रतिक्रियाएं, विशेष रूप से ग्लियोब्लास्टोमा मल्टीफोर्म कैंसर में, केवल माइक्रोग्लिया कोशिकाओं द्वारा समर्थित नहीं हैं क्योंकि रक्त मस्तिष्क बाधा एंजियोजेनिक प्रक्रियाओं और लिम्फेटिक जहाजों की उपस्थिति6,,7के माध्यम से पुनर्गठित की जाती है। इसलिए, ट्यूमर पर निर्भर एंजियोजेनेसिस तंत्र8भर में ब्रेन ट्यूमर में एक बड़ी अस्थि मज्जा-व्युत्पन्न मैक्रोफेज (बीएमडीएम) घुसपैठ होती है। कैंसर कोशिकाएं घुसपैठ बीएमडीएम पर महत्वपूर्ण प्रभाव डालती हैं जिससे इम्यूनोसप्रेसिव गुण और ट्यूमर विकास9होता है । इस प्रकार प्रतिरक्षा कोशिकाओं और उनके मस्तिष्क के सूक्ष्म वातावरण के बीच संचार को समझना मुश्किल है क्योंकि कोशिका मूल और सक्रियण संकेत विविध10,11हैं । इस प्रकार शारीरिक परिस्थितियों में प्रतिरक्षा कोशिका से जुड़े आणविक हस्ताक्षरों के कार्यों को पकड़ना दिलचस्प है। इस संबंध में, प्रतिरक्षा कोशिकाओं और सेल माइक्रोएनवायरमेंट के बीच सेल-सेल संचार का अध्ययन एक्सट्रासेलुलर वेसिकल्स (ईवीएस) की रिहाई के माध्यम से किया जा सकता है।
ईवीएस का अध्ययन स्वस्थ और रोग की स्थिति12,13में प्रतिरक्षा कार्यों के नियमन में अधिक से अधिक किया जा रहा है । दो आबादी, एक्सोसोम और माइक्रोवेसिकल्स को ध्यान में रखा जा सकता है। वे विभिन्न जैव उत्पत्ति और आकार पर्वतमाला पेश करते हैं। एक्सोसोम ~ 30-150 एनएम व्यास के वेसिकल्स हैं और एंडोसोमल सिस्टम से उत्पन्न होते हैं और प्लाज्मा झिल्ली के साथ मल्टीवेसिकुलर बॉडी (एमवीबी) के संलयन के दौरान स्रावित होते हैं। माइक्रोवेसिकल्स व्यास में लगभग 100-1,000 एनएम होते हैं और सेल प्लाज्मा झिल्ली14से एक जावक नवोदित द्वारा उत्पन्न होते हैं। क्योंकि एक्सोसोम बनाम माइक्रोवेसिकल भेदभाव अभी भी आकार और आणविक पैटर्न के अनुसार महसूस करना मुश्किल है, हम केवल वर्तमान रिपोर्ट में ईवीएस शब्द का उपयोग करेंगे । सीएनएस में ईवी-संबद्ध संचार एक पैतृक तंत्र का प्रतिनिधित्व करता है क्योंकि अध्ययनों से निमाटोड, कीड़े या एनेलिड्स15,,16सहित अकशेरुकी प्रजातियों में उनकी भागीदारी दिखाई गई। इसके अलावा, यह दर्शाने वाले परिणाम कि ईवीएस विभिन्न प्रजातियों की कोशिकाओं के साथ संवाद कर सकता है, इस तंत्र को एक कुंजी-लॉक प्रणाली के रूप में प्रदर्शित करता है, जो पहले वेसिकल्स और प्राप्तकर्ता कोशिकाओं के बीच सतह-अणु मान्यता पर आधारित होता है और फिरमध्यस्थों 16,,17के तेज होने की अनुमति देता है। दरअसल, ईवीएस में प्रोटीन (जैसे, एंजाइम, सिग्नल ट्रांसड्यूक्शन, बायोजेनेसिस फैक्टर), लिपिड (जैसे, सेरामाइड, कोलेस्ट्रॉल) या न्यूक्लिक एसिड (जैसे, डीएनए, एमआरएनए या मिरना) जैसे कई अणु होते हैं जो प्राप्तकर्ता सेल गतिविधियों14के प्रत्यक्ष या अप्रत्यक्ष नियामकों के रूप में कार्य करते हैं। यही कारण है कि ईवीएस को अलग करने और18,19के प्रोटीन हस्ताक्षरों की पूरी तरह से विशेषता के लिए प्रतिरक्षा कोशिकाओं पर पद्धतिगत अध्ययन भी किए गए .
शुरुआती अध्ययनों ने प्राथमिक सुसंस्कृत चूहे माइक्रोग्लिया से एक उत्कर्दित तंत्र के रूप में एक्सोसोम की रिहाई को एक Wnt3a-या सेरोटोनिन-निर्भर सक्रियण20,,21के बाद प्रदर्शित किया। सीएनएस में कार्यात्मक रूप से, माइक्रोग्लिया-व्युत्पन्न ईवीएस न्यूरॉन्स में प्रेसनैप्टिक टर्मिनलों द्वारा सिनैप्टिक वेसिकल रिलीज को विनियमित करता है जो न्यूरोनल एक्सीबिलिटी22,,23के नियंत्रण में योगदान देता है। माइक्रोग्लिया-व्युत्पन्न ईवीएस बड़े मस्तिष्क क्षेत्रों24,,25में साइटोकिन्स-मध्यस्थता भड़काऊ प्रतिक्रिया का प्रचार भी कर सकता है । महत्वपूर्ण बात, टोल की तरह रिसेप्टर परिवार के लिए विविध ligands माइक्रोग्लिया26में EVs के विशिष्ट प्रस्तुतियों को सक्रिय कर सकता है । उदाहरण के लिए, इन विट्रो अध्ययनों से पता चलता है कि एलपीएस-सक्रिय माइक्रोग्लिया बीवी 2 सेल लाइनें प्रो-भड़काऊ साइटोकिन्स27सहित अंतर ईवी सामग्री का उत्पादन करती हैं। इसलिए, सीएनएस, माइक्रोग्लिया और घुसपैठ बीएमडब्ल्यूएम में प्रतिरक्षा कोशिका उपआबादी की कार्यात्मक विविधता का मूल्यांकन प्राप्तकर्ता कोशिकाओं पर ईवी प्रभाव और ईवी सामग्री की पहचान सहित उनकी स्वयं की ईवी आबादी के माध्यम से किया जा सकता है।
हमने पहले माइक्रोग्लिया और बीएमडीएम-व्युत्पन्न ईवीएस के कार्यात्मक16,19गुणों का मूल्यांकन करने के तरीकों का वर्णन किया था। वर्तमान रिपोर्ट में, हम न्यूराइट आउटग्रोथ पर माइक्रोग्लिया-व्युत्पन्न ईवीएस के प्रभाव और ग्लियोमा सेल समुचित के नियंत्रण पर मैक्रोफेज-व्युत्पन्न ईवीएस के प्रभाव का स्वतंत्र रूप से मूल्यांकन करने का प्रस्ताव करते हैं। इस अध्ययन में ईवी अलगाव प्रक्रिया को मान्य करने के साथ-साथ जैविक रूप से सक्रिय प्रोटीन हस्ताक्षरों की पहचान करने के लिए ईवी अंशों के व्यापक प्रोटेओमिक विश्लेषण का भी प्रस्ताव है। लाभकारी प्रभाव और EV सामग्री के आणविक गूढ़ उनके संभावित हेरफेर और मस्तिष्क विकारों में चिकित्सीय एजेंटों के रूप में उपयोग में मदद कर सकता है ।
केंद्रीय तंत्रिका तंत्र (सीएनएस) एक जटिल ऊतक है जिसमें सेल-टू-सेल संचार होमोस्तासिस30के लिए आवश्यक सामान्य न्यूरोनल कार्यों को नियंत्रित करता है। ईवीएस अब व्यापक रूप से अध्ययन कर रहे है और सेल…
The authors have nothing to disclose.
प्रस्तुत कार्य को मिनेस्टेयर डी एल’एजुकेशन नेशनल, डी एल’एनसेग्नेमेंट सुपेरियर एट डी ला रेचे चेचे और आईएनसेआरएम द्वारा समर्थित किया गया था। हम कृतज्ञता से उपकरणों और तकनीकी सलाह के लिए उपयोग के लिए BICeL-परिसर वैज्ञानिक शहर सुविधा स्वीकार करते हैं । हम कृतज्ञता से जीन पास्कल गिमेनो, Soulaimane Aboulouard और इसाबेल फोरनियर मास स्पेक्ट्रोमेट्री सहायता के लिए स्वीकार करते हैं । हम कृतज्ञता से तनीना अरब, क्रिस्टेले वैन शिविर, फ्रेंकोइस ले Marrec-Croq, Jacopo Vizioli और पियरे एरिक Sautière वैज्ञानिक और तकनीकी विकास के लिए उनके मजबूत योगदान के लिए स्वीकार करते हैं ।
12% Mini-PROTEAN TGX Precast Protein Gels | Bio-rad | 4561045EDU | |
Acetonitrile | Fisher Chemicals | A955-1 | |
Amicon 50 kDa centrifugal filter | Merck | UFC505024 | |
Ammonium bicarbonate | Sigma-Aldrich | 9830 | |
HSP90 α/β antibody (RRID: AB_675659) | Santa-cruz | sc-13119 | |
B27 Plus supplement | Gibco | A3582801 | |
BenchMixer V2 Vortex Mixer | Benchmark Scientific | BV1003 | |
Bio-Rad Protein Assay Dye Reagent Concentrate (Bradford) | Bio-Rad | 5000006 | |
C18 ZipTips | Merck Millipore | ZTC18S096 | |
C6 rat glioma cell | ATCC | ATCC CCL-107 | |
Canonical tubes | Sarstedt | 62.554.002 | |
Centrifuge | Eppendorf | 5804000010 | |
CO2 Incubator | ThermoFisher | ||
Confocal microscope LSM880 | Carl Zeiss | LSM880 | |
Cover glass | Marienfeld | 111580 | |
Culture Dish (60 mm) | Sarstedt | 82.1473 | |
Dithiothreitol | Sigma-Aldrich | 43819 | |
DMEM | Gibco | 41966029 | |
EASY-nLC 1000 Liquid Chromatograph | ThermoFisher | ||
Electron microscope JEM-2100 | JEOL | ||
Ethylene glycol-bis(2-aminoethylether)-N,N,N′,N′-tetraacetic acid | Sigma-Aldrich | 03777-10G | |
Ethylenediaminetetraacetic acid | Sigma-Aldrich | ED-100G | |
Exo-FBS | Ozyme | EXO-FBS-50A-1 | Exosome depleted FBS |
ExoCarta database (top 100 proteins of Evs) | http://www.exocarta.org/ | ||
Fetal Bovine Serum | Gibco | 16140071 | |
Fetal Horse Serum | Biowest | S0960-500 | |
Filtropur S 0.2 | Sarstedt | 83.1826.001 | |
Fisherbrand Q500 Sonicator with Probe | Fisherbrand | 12893543 | |
FlexAnalysis | Brucker | ||
Fluorescence mounting medium | Agilent | S3023 | |
Formic Acid | Sigma-Aldrich | 695076 | |
Formvar-carbon coated copper grids | Agar scientific Ltd | AGS162-3 | |
Glucose | Sigma-Aldrich | G8769 | |
Glutaraldehyde | Sigma-Aldrich | 340855 | |
Hoechst 33342 | Euromedex | 17535-AAT | |
Idoacetamide | Sigma-Aldrich | I1149 | |
InstantBlue Coomassie Protein Stain | Expedeon | ISB1L | |
Invert light microscope CKX53 | Olympus | ||
L-glutamine | Gibco | 25030-024 | |
LabTek II 8 wells | Nunc | 154534 | |
Laemmli 2X | Bio-Rad | 1610737 | |
Laminin | Corning | 354232 | |
MaxQuant software (proteins identification software) | https://maxquant.net/maxquant/ | ||
MBT Polish stell | Brucker | 8268711 | |
MEM 10X | Gibco | 21090-022 | |
Methylcellulose | Sigma-Aldrich | M6385-100G | |
MiliQ water | Merck Millipore | ||
Milk | Regilait | REGILAIT300 | |
Mini PROTEAN Vertical Electrophoresis Cell | Bio-Rad | 1658000FC | |
MonoP FPLC column | GE Healthcare | no longer available | |
Nanosight NS300 | Malvern Panalytical | NS300 | |
NanoSight NTA software v3.2 | Malvern Panalytical | ||
NanoSight syringe pump | Malvern Panalytical | ||
Neurobasal | Gibco | 21103-049 | |
Nitrocellulose membrane | GE Healthcare | 10600007 | |
Nonidet P-40 | Fluka | 56741 | |
Nunc multidish 24 wells | ThermoFisher | 82.1473 | |
Paraformaldehyde | Electro microscopy Science | 15713 | |
PC-12 cell line | ATCC | ATCC CRL-1721 | |
Penicillin-Streptomycin | Gibco | 15140-122 | |
Peptide calibration mix | LaserBio Labs | C101 | |
Peroxidase AffiniPure Goat Anti-Mouse IgG (H+L) | Jackson ImmunoResearch | 115-035-003 | |
Perseus software (Processing of identified proteins) | https://maxquant.net/perseus/ | ||
Phalloidin-tetramethylrhodamine conjugate | Santa-cruz | sc-362065 | |
Phenylmethanesulfonyl fluoride | Sigma-Aldrich | 78830 | |
Phosphate Buffer Saline | Invitrogen | 14190094 | no calcium, no magnesium |
pluriStrainer M/ 60 µm | pluriSelect | 43-50060 | |
Poly-D-lysine | Sigma-Aldrich | P6407 | |
Polycarbonate centrifuge tubes | Beckman Coulter | 355651 | |
Protease Inhibitor | Sigma-Aldrich | S8830-20TAB | |
PureCol | Cell Systems | 5005 | |
Q-Exactive mass spectrometer | ThermoFisher | ||
rapifleX mass spectrometer | Brucker | ||
Rat cortical neurons | Cell Applications | R882N-20 | Cell origin : Derived from cerebral cortices of day 18 embryonic Sprague Dawley rat brains |
Rat Macrophage & Microglia Culture Medium | Cell Applications | R620K-100 | Cell orgin : Normal healthy Rat bone marrow |
Rat primary macrophages | Cell Applications | R8818-10a | |
Rat primary microglia | Lonza | RG535 | |
Sepharose CL-2B | GE Healthcare | 17014001 | |
Sequencing Grade Modified Trypsin | Promega | V5111 | |
Slide | Dustsher | 100204 | |
Sodium Chloride | Scharlau | SO0227 | |
Sodium Dodecyl Sulfate | Sigma-Aldrich | L3771 | |
Sodium Fluoride | Sigma-Aldrich | S7920-100G | |
Sodium hydroxide | Scharlab | SO0420005P | |
Sodium pyrophosphate | Sigma-Aldrich | S6422-100G | |
SpeedVac Vacuum Concentrator | ThermoFisher | ||
String software (functional protein association networks) | https://string-db.org/ | ||
SuperSignal West Dura extended Duration Substrate | ThermoFisher | 34075 | |
Syringe 1.0 mL | Terumo | 8SS01H1 | |
Trans-Blot SD Semi-Dry Transfer cell | Bio-Rad | 1703940 | |
Trifluoroacetic acid | Sigma-Aldrich | T6508 | |
Tris | Interchim | UP031657 | |
Tris-Glycine | Euromedex | EU0550 | |
Tween 20 | Sigma-Aldrich | P2287 | |
Ultracentrifuge | Beckman Coulter | A95765 | |
Ultracentrifuge Rotor 70.1 Ti | Beckman Coulter | 342184 | |
Uranyl acetate | Agar Scientific Ltd | AGR1260A | |
Whatman filter paper | Sigma-Aldrich | WHA10347510 | |
α-Cyano-4-hydroxycinnamic acid | Sigma-Aldrich | C2020-25G |