Den nåværende rapporten fremhever kronologiske krav til ekstracellulær vesikkel (EV) isolasjon fra mikroglia eller blod makrofager. Mikroglia-avledede EV-er ble eVer evaluert som regulatorer av neurite utvekst mens blodmakrosme-avledede EV-er ble studert i kontroll av C6 glioma celle invasjon i in vitro analyser. Målet er å bedre forstå disse EV-funksjonene som immunmedier i spesifikke mikromiljøer.
Den nevroinflammatoriske tilstanden i sentralnervesystemet (CNS) spiller en nøkkelrolle i fysiologiske og patologiske forhold. Microglia, de bosatte immuncellene i hjernen, og noen ganger de infiltrere benmargsavledede makrofagene (BMDMer), regulerer den inflammatoriske profilen til mikromiljøet i CNS. Det er nå akseptert at de ekstracellulære vesicle (EV) populasjoner fra immunceller fungerer som immun mediatorer. Dermed er deres samling og isolasjon viktig for å identifisere innholdet, men også vurdere deres biologiske effekter på mottakerceller. De nåværende dataene fremhever krologiske krav til EV-isolasjon fra mikrogliaceller eller makrofager i blodet, inkludert trinnene for ultracentrifugation og størrelseseklusjonskromatografi (SEC). En ikke-målrettet proteomisk analyse tillot validering av proteinsignaturer som EV-markører og karakteriserte det biologisk aktive EV-innholdet. Mikroglia-avledede EV-er ble også funksjonelt brukt på primær kultur av nevroner for å vurdere deres betydning som immunmeklere i neurite utveksten. Resultatene viste at mikroglia-avledede EV-er bidrar til å lette neurite utvekst in vitro. Parallelt ble blodmakrofag-avledede EV-er funksjonelt brukt som immunmeklere i sfæroide kulturer av C6 gliomaceller, resultatene som viser at disse EV-ene kontrollerer gliomacelleinvasjonen in vitro. Denne rapporten understreker muligheten for å evaluere EV-medierte immuncellefunksjoner, men forstår også de molekylære basene til en slik kommunikasjon. Denne dechiffreringen kan fremme bruk av naturlige vesikler og/eller in vitro-fremstilling av terapeutiske vesikler for å etterligne immunegenskaper i mikromiljøet av CNS-patologier.
Mange nevropatologier er relatert til nevroinflammatorisk tilstand som er en kompleks mekanisme som i økende grad vurderes, men fortsatt dårlig forstått fordi immunprosessene er forskjellige og avhenger av cellemiljøet. Faktisk involverer CNS-lidelsene ikke systematisk de samme aktiveringssignalene og immuncellepopulasjonene, og dermed er de pro- eller antiinflammatoriske reaksjonene vanskelig å vurdere som årsaker eller konsekvenser av patologier. Hjernen bosatt makrofager kalt “microglia” synes å være i grensesnittet mellom nervesystemet og immunsystemet1. Microglia har en myeloid opprinnelse og er avledet fra eggeplommesekken under primitiv hematopoiesis for å kolonisere hjernen, mens perifere makrofager er avledet fra fosterleveren under definitiv hematopoiesis for å bli perifere makrofager2. Mikrogliacellene kommuniserer med nevroner og nevron-avledede glialceller som astrocytter og oligodendrocytes3. Flere nyere studier har vist at microglia er involvert i nevronal plastisitet under CNS utvikling og voksen vev homeostase, og også i inflammatorisk tilstand forbundet med nevrodegenerative sykdommer4,5. Ellers kan integriteten til blodhjernebarrieren bli kompromittert i andre CNS-patologier. Immunresponsen, spesielt i glioblastom multiforme kreft, støttes ikke bare av mikrogliaceller, da blodhjernebarrieren omorganiseres gjennom angiogene prosesser og tilstedeværelsen av lymfatiske kar6,7. Derfor oppstår en stor benmargsavledet makrofager (BMDMer) infiltrasjon i hjernesvulsten gjennom tumoravhengige angiogenesemekanismer8. Kreftcellene utøver en betydelig innflytelse på infiltrerte BMDMer som fører til immunsuppressive egenskaper og tumorvekst9. Dermed er kommunikasjonen mellom immuncellene og deres mikromiljø i hjernen vanskelig å forstå da celleopprinnelsen og aktiveringssignalene er forskjellige10,11. Det er derfor interessant å pågripe funksjonene til immuncellerelaterte molekylære signaturer i fysiologiske forhold. I denne forbindelse kan cellecellekommunikasjonen mellom immunceller og cellemikromiljø studeres gjennom frigjøring av ekstracellulære vesikler (EV-er).
EV-ene studeres mer og mer i reguleringen av immunfunksjoner i sunne samt patologiske tilstander12,13. To populasjoner, eksosomer og mikrovesikler, kan tas i betraktning. De presenterer forskjellige biogenese og størrelsesområder. Eksosomene er vesikler på ~ 30-150 nm diameter og genereres fra endosomale systemet og utskilles under fusjon av flervesikulære organer (MVB) med plasmamembranen. Mikrokjøretøyene er ca 100-1000 nm i diameter og genereres av en ytre spirende fra cellen plasmamembranen14. Fordi eksosom versus mikrovesicle diskriminering er fortsatt vanskelig å realisere i henhold til størrelse og molekylære mønstre, vil vi bare bruke begrepet EV i den nåværende rapporten. Ev-assosiert kommunikasjon i CNS representerer en forfedremekanisme siden studier viste deres engasjement i virvelløse arter, inkludert nematoder, insekter eller annelider15,16. Videre viser resultatene som viser at EV-er kan kommunisere med celler fra forskjellige arter, denne mekanismen for å være et nøkkellåssystem, basert først på overflatemolekylgjenkjenning mellom vesikler og mottakerceller og deretter tillate opptak av meklere16,17. Faktisk inneholder EV-ene mange molekyler som proteiner (f.eks. enzymer, signaltransduksjon, biogenesefaktor), lipider (f.eks. ceramid, kolesterol) eller nukleinsyrer (f.eks. DNA, mRNA eller miRNAer) som virker som direkte eller indirekte regulatorer av mottakercelleaktivitetene14. Det er derfor metodiske studier ble også utført på immunceller for å isolere EV-er og fullt karakterisere deres proteinsignaturer18,19.
De tidligste studiene viste frigjøring av eksosomer fra primærkald rottemikroglia som en udugelig mekanisme etter en Wnt3a- eller serotoninavhengig aktivering20,21. Funksjonelt i CNS regulerer mikroglia-avledede EV-er den synaptiske vesikkelfrigivelsen ved presynaptiske terminaler i nevroner som bidrar til kontroll av nevronal spenning22,,23. Microglia-avledede EV-er kan også forplante cytokiner-mediert inflammatorisk respons i store hjerneregioner24,,25. Viktigere, de ulike ligander for toll-lignende reseptor familie kan aktivere bestemte produksjoner av EV i microglia26. In vitro-studier viser for eksempel at LPS-aktiverte microglia BV2-cellelinjer produserer differensial EV-innhold, inkludert proinflammatoriske cytokiner27. Derfor kan det funksjonelle mangfoldet av underpopulasjoner av immunceller i CNS, microglia og infiltrere BMDMer, evalueres gjennom sine egne EV-populasjoner, inkludert EV-innvirkning på mottakerceller og identifisering av EV-innhold.
Vi har tidligere beskrevet metoder for å evaluere de funksjonelle egenskapene til microglia- og BMDM-avledede EV-er etter deres isolasjon16,19. I den foreliggende rapporten foreslår vi å uavhengig vurdere effekten av mikroglia-avledede EV-er på neurite utvekst, og effekten av makrofag-avledede EV-er på kontroll av gliomacelleaggregater. Denne studien foreslår også en bred proteomisk analyse av EV-fraksjonene for å validere EV-isolasjonsprosedyren samt identifisere de biologisk aktive proteinsignaturene. De gunstige effektene og molekylær dechiffrering av EV-innhold kan hjelpe deres mulige manipulasjon og bruk som terapeutiske midler i hjernesykdommer.
Sentralnervesystemet (CNS) er et komplekst vev der celle-til-celle-kommunikasjon regulerer normale nevronale funksjoner som er nødvendige for homeostase30. EV-er er nå mye studert og beskrevet som viktig molekylær last for celle-til-celle kommunikasjon31. De leverer spesielt en cocktail av meklere til mottakerceller og påvirker dermed deres funksjoner i sunne og patologiske forhold32. Nyere studier indikerer at EV-er spiller en avgjørende rolle …
The authors have nothing to disclose.
Det presenterte arbeidet ble støttet av Ministère de L’Education Nationale, de L’Enseignement Supérieur et de la Recherche og INSERM. Vi anerkjenner takknemlig BICeL- Campus Scientific City Facility for tilgang til instrumenter og tekniske råd. Vi anerkjenner takknemlig Jean-Pascal Gimeno, Soulaimane Aboulouard og Isabelle Fournier for massespektrometrihjelpen. Vi anerkjenner takknemlig Tanina Arab, Christelle van Camp, Francoise le Marrec-Croq, Jacopo Vizioli og Pierre-Eric Sautière for deres sterke bidrag til den vitenskapelige og tekniske utviklingen.
12% Mini-PROTEAN TGX Precast Protein Gels | Bio-rad | 4561045EDU | |
Acetonitrile | Fisher Chemicals | A955-1 | |
Amicon 50 kDa centrifugal filter | Merck | UFC505024 | |
Ammonium bicarbonate | Sigma-Aldrich | 9830 | |
HSP90 α/β antibody (RRID: AB_675659) | Santa-cruz | sc-13119 | |
B27 Plus supplement | Gibco | A3582801 | |
BenchMixer V2 Vortex Mixer | Benchmark Scientific | BV1003 | |
Bio-Rad Protein Assay Dye Reagent Concentrate (Bradford) | Bio-Rad | 5000006 | |
C18 ZipTips | Merck Millipore | ZTC18S096 | |
C6 rat glioma cell | ATCC | ATCC CCL-107 | |
Canonical tubes | Sarstedt | 62.554.002 | |
Centrifuge | Eppendorf | 5804000010 | |
CO2 Incubator | ThermoFisher | ||
Confocal microscope LSM880 | Carl Zeiss | LSM880 | |
Cover glass | Marienfeld | 111580 | |
Culture Dish (60 mm) | Sarstedt | 82.1473 | |
Dithiothreitol | Sigma-Aldrich | 43819 | |
DMEM | Gibco | 41966029 | |
EASY-nLC 1000 Liquid Chromatograph | ThermoFisher | ||
Electron microscope JEM-2100 | JEOL | ||
Ethylene glycol-bis(2-aminoethylether)-N,N,N′,N′-tetraacetic acid | Sigma-Aldrich | 03777-10G | |
Ethylenediaminetetraacetic acid | Sigma-Aldrich | ED-100G | |
Exo-FBS | Ozyme | EXO-FBS-50A-1 | Exosome depleted FBS |
ExoCarta database (top 100 proteins of Evs) | http://www.exocarta.org/ | ||
Fetal Bovine Serum | Gibco | 16140071 | |
Fetal Horse Serum | Biowest | S0960-500 | |
Filtropur S 0.2 | Sarstedt | 83.1826.001 | |
Fisherbrand Q500 Sonicator with Probe | Fisherbrand | 12893543 | |
FlexAnalysis | Brucker | ||
Fluorescence mounting medium | Agilent | S3023 | |
Formic Acid | Sigma-Aldrich | 695076 | |
Formvar-carbon coated copper grids | Agar scientific Ltd | AGS162-3 | |
Glucose | Sigma-Aldrich | G8769 | |
Glutaraldehyde | Sigma-Aldrich | 340855 | |
Hoechst 33342 | Euromedex | 17535-AAT | |
Idoacetamide | Sigma-Aldrich | I1149 | |
InstantBlue Coomassie Protein Stain | Expedeon | ISB1L | |
Invert light microscope CKX53 | Olympus | ||
L-glutamine | Gibco | 25030-024 | |
LabTek II 8 wells | Nunc | 154534 | |
Laemmli 2X | Bio-Rad | 1610737 | |
Laminin | Corning | 354232 | |
MaxQuant software (proteins identification software) | https://maxquant.net/maxquant/ | ||
MBT Polish stell | Brucker | 8268711 | |
MEM 10X | Gibco | 21090-022 | |
Methylcellulose | Sigma-Aldrich | M6385-100G | |
MiliQ water | Merck Millipore | ||
Milk | Regilait | REGILAIT300 | |
Mini PROTEAN Vertical Electrophoresis Cell | Bio-Rad | 1658000FC | |
MonoP FPLC column | GE Healthcare | no longer available | |
Nanosight NS300 | Malvern Panalytical | NS300 | |
NanoSight NTA software v3.2 | Malvern Panalytical | ||
NanoSight syringe pump | Malvern Panalytical | ||
Neurobasal | Gibco | 21103-049 | |
Nitrocellulose membrane | GE Healthcare | 10600007 | |
Nonidet P-40 | Fluka | 56741 | |
Nunc multidish 24 wells | ThermoFisher | 82.1473 | |
Paraformaldehyde | Electro microscopy Science | 15713 | |
PC-12 cell line | ATCC | ATCC CRL-1721 | |
Penicillin-Streptomycin | Gibco | 15140-122 | |
Peptide calibration mix | LaserBio Labs | C101 | |
Peroxidase AffiniPure Goat Anti-Mouse IgG (H+L) | Jackson ImmunoResearch | 115-035-003 | |
Perseus software (Processing of identified proteins) | https://maxquant.net/perseus/ | ||
Phalloidin-tetramethylrhodamine conjugate | Santa-cruz | sc-362065 | |
Phenylmethanesulfonyl fluoride | Sigma-Aldrich | 78830 | |
Phosphate Buffer Saline | Invitrogen | 14190094 | no calcium, no magnesium |
pluriStrainer M/ 60 µm | pluriSelect | 43-50060 | |
Poly-D-lysine | Sigma-Aldrich | P6407 | |
Polycarbonate centrifuge tubes | Beckman Coulter | 355651 | |
Protease Inhibitor | Sigma-Aldrich | S8830-20TAB | |
PureCol | Cell Systems | 5005 | |
Q-Exactive mass spectrometer | ThermoFisher | ||
rapifleX mass spectrometer | Brucker | ||
Rat cortical neurons | Cell Applications | R882N-20 | Cell origin : Derived from cerebral cortices of day 18 embryonic Sprague Dawley rat brains |
Rat Macrophage & Microglia Culture Medium | Cell Applications | R620K-100 | Cell orgin : Normal healthy Rat bone marrow |
Rat primary macrophages | Cell Applications | R8818-10a | |
Rat primary microglia | Lonza | RG535 | |
Sepharose CL-2B | GE Healthcare | 17014001 | |
Sequencing Grade Modified Trypsin | Promega | V5111 | |
Slide | Dustsher | 100204 | |
Sodium Chloride | Scharlau | SO0227 | |
Sodium Dodecyl Sulfate | Sigma-Aldrich | L3771 | |
Sodium Fluoride | Sigma-Aldrich | S7920-100G | |
Sodium hydroxide | Scharlab | SO0420005P | |
Sodium pyrophosphate | Sigma-Aldrich | S6422-100G | |
SpeedVac Vacuum Concentrator | ThermoFisher | ||
String software (functional protein association networks) | https://string-db.org/ | ||
SuperSignal West Dura extended Duration Substrate | ThermoFisher | 34075 | |
Syringe 1.0 mL | Terumo | 8SS01H1 | |
Trans-Blot SD Semi-Dry Transfer cell | Bio-Rad | 1703940 | |
Trifluoroacetic acid | Sigma-Aldrich | T6508 | |
Tris | Interchim | UP031657 | |
Tris-Glycine | Euromedex | EU0550 | |
Tween 20 | Sigma-Aldrich | P2287 | |
Ultracentrifuge | Beckman Coulter | A95765 | |
Ultracentrifuge Rotor 70.1 Ti | Beckman Coulter | 342184 | |
Uranyl acetate | Agar Scientific Ltd | AGR1260A | |
Whatman filter paper | Sigma-Aldrich | WHA10347510 | |
α-Cyano-4-hydroxycinnamic acid | Sigma-Aldrich | C2020-25G |