3D 스페로이드 모델은 시험관 내 암 관련 섬유아세포 분화 및 침입을 위한 보다 생리적 시스템으로
Summary
이 프로토콜의 목표는 면역 형광, 전사와 같은 다른 분석 시스템에서 해결 될 수있는 종양 벌크와 같은 환경에서 암 관련 섬유 아세포 (CAFs)의 분화를 연구하는 3D 체외 모델을 확립하는 것입니다. 분석 및 생명 세포 화상 진찰.
Abstract
시험관 내 연구에 대한 이상적인 모델을 정의하는 것은 필수적입니다, 세포의 분화와 같은 생리적 과정을 공부하는 경우 주로. 종양 기질에서, 호스트 섬유아세포는 분화하기 위하여 암세포에 의해 자극됩니다. 따라서, 그(것)들은 종양 미세 환경에 기여하고 종양 진행을 지원하는 표현형을 취득합니다. 스페로이드 모델을 사용하여, 우리는 이러한 3D 체외 모델 시스템을 설정하여, 우리는 이 분화 과정에서 라미닌-332 및 그 수용체 인테그린 α3β1의 역할을 분석했습니다. 이 스페로이드 모델 시스템은 종양 미세 환경 조건을 보다 정확한 방식으로 재현할 뿐만 아니라 세포 내 및 세포 외의 면역 형광 염색과 같은 다양한 다운스트림 연구를 허용하기 때문에 매우 다재다능한 모델입니다. 마커뿐만 아니라 퇴적 된 세포 외 매트릭스 단백질. 더욱이, qPCR에 의한 전사 분석, 유세포 분석 및 세포 침입은 이 모델로 연구될 수 있다. 여기서, 우리는 CAFs의 인테그린 α3β1 및 그 ectopically 증착 리간드, 라미닌-332의 역할을 평가하기 위한 스페로이드 모델의 프로토콜을 분화하고 췌장암 세포의 침입을 지원하는 것을 기술한다.
Introduction
종양 미세 환경은 매우 복잡한 틈새 시장이며 종양 세포의 유지및 진행에 매우 중요합니다 1. 그것은 암세포뿐만 아니라 기질 섬유 아세포에 의해 형성됩니다. 종양 세포는 정상 조직의 기질과 특이적이고 다른 기질로 둘러싸여있습니다2. 라미닌-332는 췌장 선암종3과같은 상이한 종양의 기질에서 ectopically 발현되는 세포외 기질 단백질이다. 더욱이, ECM의 생화학적 조성물은 또한 그 생물학적 특성, 예: 강성 및 장력, 종양 벌크 내의 변화4. 이 종양 기질, 또는 “반응성 기질”은 인접한 암세포에 섬유아세포의 적응과 종양 진행을 위한 유리하고 지지적인 환경을 개발하는 그밖 아주 중요한 선수의 모집에 기인합니다. 기질 섬유아세포의 분화는 암 관련 섬유아세포 (CAF)를 초래합니다. 이들 세포는 α-평활근 액틴(αSMA)5 또는 신경/신경교항원 2(NG2)6과 같은 상이한 마커를 사용하여 식별될 수 있다.
CAFs를 사용하여 종양 미세환경(TME)을 재량화하는 데 가장 적합한 시험관내 모델은 선택하기 어렵다. 이러한 모델 시스템에 대해 비용 효율적이고 재현 가능한 방식으로 TME의 생리적 파라미터를 모방하는 방법을 고려해야 합니다. TME 내에서, 상이한 세포 모형의 증식, 분화, 이동 및 침략과 같은 다른 프로세스가 생깁니다. 이러한 세포 과정은 다른 방법으로 개별적으로 수행 될 수있다. 그러나, 실험 조건은 종양 기질 ECM과의 세포 상호 작용을 고려해야 합니다, 지층의 강성은 CAF 분화 과정에 영향을 미치기 때문에. R.G. Wells는 세포 행동에 대한 매트릭스 강성의 영향에 대해 논평하고 시험관 내 배양 세포에서 관찰된 세포골격조직 및 분화 상태가 artefactual 7일 수 있음을 강조했다. 다른 자극은 기계적 장력5,7을포함하여 CAF 분화에 관여하는 것 같습니다. 이를 피하기 위해 2D 연질 기판은 경직된 배양 접시 플라스틱의 문제를 우회하기 때문에 분화 연구를 위한 가능한 접근법이 될 수 있습니다. 섬유 아세포가 성장 할 수있는 부드러운 2D 표면은 콜라겐 – I 코팅 폴리 아크릴 아미드 젤일 수 있으며, 이에 따라 젤 강성은 폴리 아크릴 아미드 및 젤 크로스 링커의 농도에 의해 조작 될 수 있습니다. αSMA가 풍부한 스트레스 섬유의 접착력 및 형성은 겔 강성과 함께섬유아세포에서 강화된다 8. 이러한 결과는 더 많은 생리적 체외 분화 모델에 대한 부드러운 기판 스캐폴드의 중요성을 강조한다. 그러나, 우리의 손에 이 젤의 실험적인 재현성 그리고 화상 진찰은 도전적이었습니다. 이러한 단점을 극복하기 위해 차별화 및 침입 연구를 위한 3D 스페로이드 모델을 위한 2D 소프트 기판 시스템을 변경했습니다. 이 모델은 보다 임상적으로 관련성이 있고, 생체외 오르가노이드와 유사하게, 생체 내 세포-세포 상호작용, ECM 생산 및 증착, 세포 행동 뿐만 아니라 재류도있다9.
스페로이드는 세포가 부착하는 기질이 부족할 때 형성됩니다. 세포가 접착제 표면없이 남아있을 때, 그들은 더 많거나 적은 구형 구조를 형성하기 위해 집계. 스페로이드가 한 가지 유형의 세포로 구성되어 있다면 호모스페로이드라고합니다. 2 개 이상의 다른 세포 유형으로 구성 하는 경우 그들은 헤 테 로스 페로이드를 형성.
스페로이드 제제를 위한 상이한 방법 들 중, 우리는 비부착 원형 바닥 96 웰 플레이트를 사용하여 프로토콜을 수행한다. 그것은 비용에 관하여 매우 효과적입니다. 여기서, 우리는 침략을 연구하기 위하여 섬유아세포, CAF 또는 CAF의 호모스페로이드를 둘 다 생성합니다. 주변 매트릭스로 들어갑니다.
이 연구 결과를 위한 목표는 인간 적인 췌장 암종 생검에서 격리된 1 차적인 CAFs를 이용하기 위한 것이었습니다. 그러나, 세포를 장악하기 위하여 생검은 부족하고 이 이유로, 이 연구 결과에서 사용된 CAFs는 HTERT를 포함하는 lentivirus를 사용하여 불멸되었습니다. 그(것)들은 iCAFs에게 불리고, 그들의 일반적인 대응, 1 차적인 인간 췌장 섬유아세포는, iNFs에게 불립니다. 인간 췌장 섬유아세포 및 췌장 덕트 암종 세포인 AsPC-I 및 PANC-I는 시판되고 있다.
이 프로토콜은 CAF 분화 과정에서 라미닌-332-인테그린 상호작용의 효과를 연구하는데 사용되었다. 이러한 상호작용과 그 기능의 특이성을 증명하기 위해, 억제제 화합물이 사용되었다: BM2, 인테그린 결합 부위를 차단하는 단일클론 항체는 라미닌-332 α3사슬(10)또는 레빈 1, 뱀 독 유래 화합물을 차단하는 라미닌 결합 인테그린 α3β1, α6β1 및 α7β111,12.
침략 분석의 경우, 세포는 이종세포에서 상이한 세포 유형을 구별하기 위해 mCherry(iCAF및 인테그린 α3 KO iCAF) 또는 GFP(AsPC-I 및 PANC-I)를 코딩하는 cDNA를 포함하는 렌티바이러스로 트랜스사이링되었다. 그(것)들을 불멸화하고 형광 성 단백질 (mCherry 및 GFP) 식으로 그(것)들을 표지하기 위하여 세포의 transduction는 추가 정보를 위해 상담되어야 하는 이전 연구13에서기술됩니다.
Protocol
Representative Results
Discussion
CAF 분화를 연구하기 위한 적절한 시험관내 모델을 개발하는 것은 어려운 과제이다. 다른 접근법을 채택한 후에, 우리는 3D 스페로이드 모형이 불멸의 CA와 췌장 암종 세포 사이 상호 작용을 공부할 수 있는 더 실용적이고 생리적이고 임상적으로 관련있는 모형이다는 것을 결론을 내렸습니다. 이 모델은 적어도 단기 배양 조건 (최대 48 시간)에서 세포 배양 플라스틱의 강성과 같은 artefactual 스트레스…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
우리는 BM2와 lebein-1을 준비하는 바바라 셰딩의 도움을 인정합니다. 우리는 스페로이드 검소에 그녀의 전문 지식을 공유에 대한 Àgnes 노엘을 인정합니다. 우리는 S2 조건하에서 렌티 바이러스 형질 감염을 처리하는 데 도움을 준 소냐 셸하스와 마이클 셰퍼스에게 감사드립니다. 우리는 췌장암 조직에서 CAF를 준비하는 사빈 폰 뤼덴의 도움을 인정합니다.
이러한 결과로 이어지는 연구는 유럽 연합의 일곱 번째 프레임 워크 프로그램 FP7 / 2007-2013 / REA 보조금 계약 n ◦ (316610)에 따라 유럽 연합 (EU)의 일곱 번째 프레임 워크 프로그램 (마리 퀴리 액션)에서 자금을 받았다 J.A.E. 또한 J.A.E.와 A.C.M.C.는 엑셀인 모션 클러스터(EXC 1003-CiM) 내에서 도이치 포충제마인샤프트(DFG)의 재정적 지원을 받았습니다. 이 프로젝트는 또한 빌헬름 산더 스티퉁 (부여: 2016.113.1 J.A.E.)에 의해 지원되었다.
Materials
| 4',6-Diamidino-2-Phenylindole, Dihydrochloride (DAPI) | SIGMA-ALDRICH | D9542-10 | |
| 6F12 anti-Laminin β3 subunit Mouse (monoclonal) | Homemade | ||
| A3IIF5 Anti-α3 integrin subunit Mouse (monoclonal) | Kindly provided by Prof. M. Hemler, Dana Faber-Cancer Institute, Boston | ||
| Acetone | SIGMA-ALDRICH | 32201 | |
| Albumin Fraction V – BSA | AppliChem | A1391 | |
| Alexa fluor 488 Goat (polyclonal) anti-Mouse | Invitrogen | A11029 | |
| Alexa fluor 488 Goat (polyclonal) Rabbit | Invitrogen | A11034 | |
| Anti-laminin γ2 subunit Mouse (monoclonal) | Santa Cruz | sc-28330 | |
| Anti-NG2 Rabbit (polyclonal) Millipore, AB5320 | Millipore | AB5320 | |
| Anti-α-SMA-Cy3 Mouse (monoclonal) | SIGMA-ALDRICH | C6198 | |
| AsPC-1 cell line | ATCC | Kindly given by prof. Jorg Haier's Lab | |
| Bench centrifuge | Fisher Scientific | 50-589-620 | Sprout |
| BM2 anti-laminin α3 subunit Mouse (monoclonal) | Kindly provided by Prof. Patricia Rousselle, CNRS, Lyon | ||
| Calcium Chloride (CaCl2) | Fluka | 21074 | |
| Centrifuge | Thermo Scientific | Multifuge 1S-R | |
| Centrifuge tubes 50 mL | Corning | 430290 | |
| Collagenase B | Roche | 11088831001 | |
| Collagen-I, rat tail | Gibco | A10483-01 | |
| Confocal microscope | Zeiss | LSM 700 and 800 | |
| DMEM (High glucose 4.5 g/L) | Lonza | BE12-604F | |
| Dnase I | Roche | 10104159001 | |
| Flow Cytometer | BD Biosciences | FACSCaliburTM | |
| Gelifying matrix | ThermoFisher Scientific | A1413202 | Matrigel, Geltrex |
| Goat IgG, isotype | DAKO | X 0907 | |
| Horse Serum | SIGMA-ALDRICH | 12449-C | |
| Human Primary Pancreatic Fibroblasts | PELOBiotech | PB-H-6201 | |
| Incubator | Heraeus | B6060 | |
| Laminin-332 | Biolamina | LN332 | |
| MEM | SIGMA-ALDRICH | M4655 | |
| Microplate, 96 wells, U-bottom | Greiner Bio-One | 650101 | |
| Microscope Slides | Thermo Scientific | J1800AMNZ | |
| Mouse IgG, isotype | SIGMA-ALDRICH | I8765 | |
| Multi axle rotating mixer | CAT | RM5 80V | |
| PANC-I | ATCC | Kindly given by Prof. Jorg Haier's Lab | |
| Paraformaldehyde | Riedel-de Haën | 16005 | |
| Penicillin/streptomycin | Gibco | 15140-122 | |
| QuantiTect Reverse Transcription Kit | Qiagen | 205310 | |
| Rat IgG, isotype | Invitrogen | 10700 | |
| Reaction tubes, 1.5 mL | Greiner Bio-One | 616201 | |
| Real-time PCR cycler | Qiagen | Rotor-Gene Q | |
| RNeasy Mini Kit | Qiagen | 74104 | |
| Rotor Gene SYBR Green PCR Kit | Qiagen | 204074 | |
| RPMI | Lonza | BE12-702F | Add glucose to 4.5 g (0.2 um filter) and 1% sodium pyruvate |
| TritonX-100 | SIGMA-ALDRICH | X100RS | |
| Vórtex | Scientific Industries | Vortex-Genie 2 | |
| μ-Slide Angiogenesis, uncoated | Ibidi | 81501 |
References
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