पूर्व-संयोजित Cas9/guide RNA ribonucleoप्रोटीन परिसरों की प्रत्यक्ष वितरण hematopoietic कोशिकाओं में जीनोम संपादन के लिए एक तेज और कुशल साधन है। यहाँ, हम इस दृष्टिकोण का उपयोग करने के लिए एक RUNX1 intronic साइलेंसर को नष्ट करने और OCI-AML3 ल्यूकेमिक कोशिकाओं में ट्रांसक्रिप्शनल प्रतिक्रियाओं की जांच.
मानव जीनोम के थोक ($98%) गैर-कोडिंग दृश्यों के शामिल है. Cis-नियामक तत्व (CREs) गैर-कोडिंग डीएनए अनुक्रम हैं जिसमें जीन अभिव्यक्ति को मॉड्युलेट करने के लिए ट्रांसक्रिप्शनल नियामकों के लिए बाध्यकारी साइटें होती हैं. सीआरई के परिवर्तन कैंसर सहित विभिन्न रोगों में फंसाया गया है। जबकि प्रमोटरों और enhancers जीन विनियमन के अध्ययन के लिए प्राथमिक CREs किया गया है, बहुत कम साइलेंसर की भूमिका के बारे में जाना जाता है, जो CRE का एक और प्रकार है कि जीन दमन मध्यस्थता है. मूल रूप से प्रोकैरियोट में एक अनुकूली प्रतिरक्षा प्रणाली के रूप में पहचान की, CRISPR/Cas9 यूकैरियोटिक जीनोम संपादन के लिए एक शक्तिशाली उपकरण होने के लिए शोषण किया गया है। यहाँ, हम मानव RUNX1 जीन में एक intronic साइलेंसर को नष्ट करने और OCI-AML3 ल्यूकेमिक कोशिकाओं में जीन अभिव्यक्ति पर प्रभावों की जांच करने के लिए इस तकनीक का उपयोग प्रस्तुत करते हैं। हमारा दृष्टिकोण दो preassembled Cas9/guide RNA (gRNA) ribonucleoप्रोटीन (RNP) परिसरों के इलेक्ट्रोपोरोनेशन-मध्यस्थ वितरण पर निर्भर करता है दो डबल-स्ट्रैंड ब्रेक (डीएसबी) कि साइलेंसर पार्श्व बनाने के लिए. हटाने आसानी से टुकड़ा विश्लेषण द्वारा जांच की जा सकती है. वैकल्पिक प्रवर्तकों से लिखित विभिन्न एमआरनए का अभिव्यक्ति विश्लेषण प्रवर्तक-निर्भर प्रभावों का मूल्यांकन करने में सहायता करता है। इस रणनीति का उपयोग अन्य सीआरई का अध्ययन करने के लिए किया जा सकता है और हेमेटोपोएटिक कोशिकाओं के लिए विशेष रूप से उपयुक्त है, जो अक्सर प्लाज्मिड-आधारित तरीकों के साथ ट्रांसफेक्ट करना मुश्किल होता है। एक प्लाज्मिड और वायरस मुक्त रणनीति का उपयोग जीन नियामक कार्यों के सरल और तेजी से आकलन की अनुमति देता है.
Cis-नियामकतत्व (CREs) गैर-कोडिंग डीएनए अनुक्रम हैं जिनमें जीन अभिव्यक्ति1,2को नियंत्रित करने के लिए ट्रांसक्रिप्शनल नियामकों के लिए बाध्यकारी साइटें होती हैं. इन तत्वों को आम तौर पर कर रहे हैं 100 करने के लिए 1,000 आधार जोड़े (bp) लंबे. प्रमोटरों और enhancers सीआरई के दो सबसे विशेषता प्रकार हैं. प्रमोटरों प्रतिलेखन शुरू साइटों के करीब निकटता में मौजूद हैं और प्रतिलेखन की बुनियादी इकाई का गठन. अनेक जीनों में एक से अधिक प्रवर्तक होते हैं और उनके वैकल्पिक उपयोग का योगदान प्रतिलेखन विविधता तथा ऊतक विशिष्टता3,4में होता है . दूसरी ओर, enhancers प्रतिलेखन को सक्रिय करने और ऊपर, बहाव या लक्ष्य जीन के introns के भीतर स्थित किया जा सकता है. बढ़ाने दूर से कार्य कर सकते हैं (एक megabase से अधिक) और अभिविन्यास के स्वतंत्र1,2. सीआरई में साइलेंसर और इंसुलेटर5,6 भी शामिलहैं. पूर्व कार्य विपरीत enhancers के लिए ट्रांसक्रिप्शनल दमनकारी के लिए बाध्यकारी द्वारा जीन अभिव्यक्ति को बाधित करने के लिए, जबकि बाद में असतत topologically डोमेन में जीनोम विभाजन पड़ोसी डोमेन से अन्य CREs से जीन को बचाने के लिए. ये तत्व लघु और/या लंबी दूरी के क्रोमैटिन बातचीत के माध्यम से एक दूसरे के साथ मिलकर कार्य करते हैं और उचित spatiotemporal जीन अभिव्यक्ति को निर्देशित करने के लिए नियामक केन्द्रों में आयोजित किए जाते हैं। उच्च-थ्रूपुट अनुक्रमण तकनीकों में हाल की प्रगति ने कई सीआरई की पहचान और कार्यात्मक एनोटेशन को त्वरित किया है जिसने वंश-विशिष्ट जीन को निर्देशित करने वाले ट्रांसक्रिप्शनल नेटवर्क की हमारी समझ को बहुत आसान बना दिया है विभिन्न कोशिकाओं और ऊतकों में अभिव्यक्ति7,8,9,10,11,12.
प्रतिलेखन को विनियमित करने में CREs की मौलिक भूमिकाओं को देखते हुए, उनके परिवर्तन aberant जीन अभिव्यक्ति के लिए नेतृत्व कर सकते हैं. यह दिखाया गया है कि सीआरई अक्सर मानव कैंसर के विभिन्न प्रकार में आनुवंशिक और epigenetic परिवर्तन द्वारा बाधित कर रहे हैं, जिससे ट्यूमर दीक्षा, प्रगति और आक्रामकता13,14के लिए योगदान . इसके अलावा, सीआरई बाध्यकारी कारकों अक्सर उत्परिवर्तित कर रहे हैं और / सीआरई भी संरचनात्मक विपथन से प्रभावित हो सकते हैं, जैसा कि इम्यूनोग्लोबुलिन भारी (आईजीएच) जीन बढ़ाने के लगातार गुणसूत्र पुनर्व्यवस्थाओं द्वारा उदाहरणदिया जाता है जिसके परिणामस्वरूप बी-सेल लिंफोमा में पड़ोसी ऑनकोजेन्स 16 की असामान्य सक्रियण होती है। घातक माइलॉयड ल्यूकेमिया (एएमएल) में, गुणसूत्र 3Q पुनर्व्यवस्थाद्वारा एक एकल बढ़ाने की repositioning सहवर्ती GATA2 downregation और EVI1 सक्रियण, जो संभावित बढ़ाने कार्यों की शर्त अवरोध द्वारा लक्षित किया जा सकता है का कारण बनता है 17.हाल ही में, हम एक उपन्यास गुणसूत्र स्थानांतरण एक RUNX1 intronic साइलेंसर है कि एक बाल चिकित्सा रोगी18में एएमएल प्रगति के लिए योगदान कर सकते हैं के क्षोभ शामिल विशेषता . इस प्रकार, गैर-कोडिंग कैंसर जीनोम को समझने से रोग रोगजनन, बायोमार्कर खोज और चिकित्सीय हस्तक्षेपों को स्पष्ट करने के लिए उपयोगी अवसर प्रदान होते हैं, जो अंततः रोगी परिणामों में सुधार करते हैं।
CRISPR/Cas9 न्यूक्लिएस मार्ग, मूल रूप से प्रोकैरियोटिक कोशिकाओं में एक अनुकूली प्रतिरक्षा प्रणाली के रूप में पहचान की, जीवित कोशिकाओं और जीवों में साइट-विशिष्ट जीनोमिक संपादन के लिए एक तेजी से और लागत प्रभावी साधन के रूप में शोषण किया गया है19,20 ,21,22. CRISPR/Cas9 प्रणाली दो प्रमुख घटक शामिल हैं: gRNA और Streptococus pyogenes– व्युत्पन्न Cas9 nuclease. GRNA लक्ष्य क्षेत्र पहचानता है और संपादन के लिए Cas9 निर्देशित प्रोटोस्पेसर नामक एक विशिष्ट अनुक्रम शामिल हैं। GRNA दो भागों से बना है: CRISPR आरएनए (crRNA), आम तौर पर एक 20-मर न्यूक्लिओटाइड अनुक्रम लक्ष्य डीएनए के पूरक, और एक ट्रांस सक्रिय crRNA (tracrRNA), जो nuclease के लिए एक बाध्यकारी पाड़ के रूप में कार्य करता है. एक प्रोटोस्पेसर आसन्न आकृति (PAM) (5′-NGG) तुरंत लक्ष्य साइट के निकट Cas9 दरार के लिए आवश्यक है और दरार साइट स्थित है 3 न्यूक्लियोटाइड PAM के ऊपर. CRISPR/Cas9-मध्यस्थ जीन संपादन आमतौर पर transfecting कोशिकाओं द्वारा किया जाता है एक प्लाज्मिड के साथ जो Cas9 को एन्कोड करता है और क्लोन gRNA23. हालांकि, यह दृष्टिकोण हेमेटोपोएटिक कोशिकाओं के लिए चुनौतीपूर्ण है, जो अक्सर ट्रांसफेक्ट करने के लिए मुश्किल होते हैं और लंबा वायरस-आधारित ट्रांसडक्शन तरीकों की आवश्यकता होती है। एक वैकल्पिक दृष्टिकोण preassembled Cas9/gRNA RNP परिसरों24के प्रत्यक्ष सेलुलर वितरण है. आरएनपी वितरण के लिए एक आम विधि इलेक्ट्रोपोरण है, जो कोशिका झिल्ली में अस्थायी छिद्र उत्पन्न करता है, इस प्रकार कोशिकाओं में आरएनपी परिसरों के प्रवेश की अनुमति देता है25,26. इस दृष्टिकोण के लाभ में उपयोग में आसानी, कम ऑफ-लक्ष्य प्रभाव और आरएनपी परिसरों की स्थिरता शामिल है। यहाँ, हम OCI-AML3 ल्यूकेमिया सेल लाइन18में एक RUNX1 intronic साइलेंसर की ट्रांसक्रिप्शनल भूमिका की जांच करने के लिए आरएनपी वितरण विधि का उपयोग करने के एक प्रोटोकॉल का वर्णन, जो एक एएमएल रोगी के परिधीय रक्त से स्थापित किया गया था फ्रेंच-अमेरिकी-ब्रिटिश M4 उपप्रकार27के साथ का निदान | प्रोटोकॉल crRNA के डिजाइन, आरएनपी परिसरों की तैयारी, इलेक्ट्रोपोरेशन के साथ ही स्क्रीनिंग और वांछित क्लोन के बाद लक्षण शामिल हैं.
CRISPR/Cas9 प्रणाली जीनोम संपादन अनुप्रयोगों की एक विस्तृत श्रृंखला में इस्तेमाल किया गया है जैसे जीन नॉकआउट और दस्तक में अध्ययन35,36, प्रतिलेखन विनियमन37,38, विभिन्न की आनुवंशिक इंजीनियरिंग निलेश जीव39,40,41,42,43,44 और जीन चिकित्सा45,46. यहाँ, हम RUNX1 जीन पर एक intronic साइलेंसर को हटाने के कार्यात्मक परिणामों की जांच करने के लिए CRISPR/Cas9 के उपयोग का प्रदर्शन. हमारे दृष्टिकोण में CRISPR घटकों की डिलीवरी प्लाज्मिड डीएनए पर निर्भर नहीं था, gRNA या वायरस की क्लोनिंग लेकिन preassembled Cas9/gRNA RNP परिसरों के विद्युत poration. यह दिखाया गया है कि बहिर्जात डीएनए का उपयोग मेजबान जीनोम में विदेशी वेक्टर दृश्यों के अवांछनीय एकीकरण के साथ जुड़ा हो सकता है, विषाक्तता में वृद्धि हुई और कम दक्षता25,47,48, जबकि वायरस transduction तरीकों समय लेने वाली हैं. इसके अलावा, प्लाज्मिड डीएनए से Cas9 की लंबी अभिव्यक्ति बंद लक्ष्य प्रभाव48बढ़ा सकते हैं. इसके विपरीत, प्रत्यक्ष आरएनपी-आधारित वितरण दृष्टिकोण को पसंदीदा विधि के रूप में स्थापित किया गया है क्योंकि यह बेहतर संपादन दक्षता, चयनात्मकता और सेल व्यवहार्यता के साथ तेज और सीधा है। वास्तव में, lipofection49,50, इलेक्ट्रोपोरेशन25,51,नैनोकणों52, सेल-पेरेटिंग पेप्टाइड्स53, iTOP54 और TRIAMF के रूप में तरीकों की एक किस्म 55 कुशल CRISPR/Cas9 वितरण के लिए विभिन्न सेल प्रकार के रूप में के रूप में अच्छी तरह से पशु और पौधों की प्रजातियों24,25,26,56,57 में विकसित किया गया है , 58 , 59 , 60 , 61 , 62 , 63.चूंकि गैर-कोडिंग डीएनए अनुक्रम आनुवंशिक विविधताओं के आकर्षण के केंद्र हैं64, लक्ष्य में सामान्य SNPs/indels की उपस्थिति की जाँच और पड़ोसी पीएएम दृश्यों विशेष रूप से प्रासंगिक है जब gRNA डिजाइन कि नियामक लक्ष्य तत्वों.
CRISPR/Cas9 जीनोम संपादन में एक बाधा नमूने की एक बड़ी संख्या में वांछित उत्परिवर्ती क्लोन की स्क्रीनिंग शामिल है. हम फ्लोरोसेंट पीसीआर कार्यरत स्क्रीनिंग के लिए केशिका जेल इलेक्ट्रोफोरोसिस के साथ मिलकर के रूप में लक्ष्य उत्परिवर्तन के बारे में 300 बीपी का एक छोटा सा जीनोमिक विलोपन है. इस विधि तेजी से और संवेदनशील है और एक उच्च throughput फैशन में किया जा सकता है. इसके अलावा, इस विधि उत्परिवर्ती स्तर और हटाने के आकार का सही आकलन एक साथ अनुमति देता है. इसके अलावा, विभिन्न फ्लोरोसेंट रंगों के साथ लेबल पीसीआर टुकड़े के मल्टीप्लेक्स विश्लेषण का समर्थन किया है। हम नियमित रूप से इस तकनीक का उपयोग माइलॉयड नियोप्लाज्म65,66में जीनोटाइप छोटे निवेशों/ हमारे अनुभव में, हम लगातार टुकड़ा आकार है कि उच्च परिशुद्धता और उत्परिवर्ती बोझ के साथ 4 बीपी से अलग कर रहे हैं का पता लगा सकते हैं $3 % करने के लिए नीचे. हालांकि, यह ध्यान दिया जाना चाहिए कि इस विधि में 1,200 बीपी का एक टुकड़ा आकार सीमा है, और इस प्रकार यह बड़े विलोपन की स्क्रीनिंग के लिए उपयुक्त नहीं है। इसके अलावा, आधार प्रतिस्थापन (अपरिवर्तित टुकड़ा आकार में परिणाम) और अन्य जीनोमिक क्षेत्रों में संभावित ऑफ-लक्ष्य घटनाओं का पता नहीं लगाया जा सकता है। बाद के लिए, महंगा पूरे जीनोम अनुक्रमण व्यापक लक्ष्य क्लोन में वैश्विक अवांछनीय परिवर्तन प्रोफ़ाइल करने के लिए आवश्यक है। बड़े गैर-कोडिंग नियामक दृश्यों की जांच के लिए हमारे वर्तमान दृष्टिकोण को अपनाने के लिए (gt; 1,000 बीपी), एक विस्तृत विलोपन और putative प्रतिलेखन कारक बाइंडिंग साइटों के mutagenesis विश्लेषण इन विट्रो रिपोर्टर जीन परख का उपयोग कर प्रदर्शन किया जा सकता है CRISPR/Cas9 संपादन18के लिए न्यूनतम कार्यात्मक क्षेत्र को रेखांकित करने के लिए पहले से .
चूंकि कई जीनों में एक से अधिक प्रवर्तक3,4होते हैं , इसलिए लक्ष्य जीन टिड्डी में वैकल्पिक प्रवर्तकों के अस्तित्व के बारे में जागरूक होना महत्वपूर्ण है क्योंकि विनियामक तत्वों में हेर-फेर करने से प्रवर्तकों में अंतर प्रभावित हो सकता है। इस प्रकार, विभिन्न प्रमोटरों से व्युत्पन्न ट्रांसक्रिप्ट वेरिएंट को किसी भी प्रमोटर-विशिष्ट प्रतिक्रियाओं का मूल्यांकन करने के लिए अलग-अलग मापा जाना चाहिए। TakMan जांच आधारित परख का उपयोग बेहतर विशिष्टता और reproducibility की वजह से SYBR ग्रीन पर पसंद किया जाता है. यदि और अधिक उन्नत डिजिटल पीसीआर प्रणाली उपलब्ध है, प्रतिलिपि परिमाणीकरण मानक वक्र निर्माण की आवश्यकता के बिना और अधिक ठीक किया जा सकता है.
कैंसर सेल लाइनों में CRISPR/Cas9 प्रयोगों के प्रदर्शन में एक महत्वपूर्ण विचार loidy और लक्ष्य जीन प्रतिलिपि संख्या लगभग सभी कैंसर सेल लाइनों के रूप में इस्तेमाल किया कोशिकाओं में संरचनात्मक और प्रतिलिपि संख्या विविधताओं सहित आनुवंशिक परिवर्तन बंदरगाह है. हमारे मामले में, OCI-AML3 45 से 50 गुणसूत्रों के साथ एक hyperdipoid karyotype है. इसके अलावा, सेल लाइन एक सामान्य RUNX1 प्रतिलिपि संख्या ले के रूप में कैंसर सेल लाइन विश्वकोश67 और situ संकरीकरण अध्ययन में फ्लोरोसेंट से पता चला पाया गया18. प्रतिलिपि संख्या लाभ के साथ किसी जीन को लक्षित करते समय, वितरण विधि को संपादन के लिए CRISPR घटकों के पर्याप्त स्तर प्रदान करने के लिए ऑप्टिमाइज़ करने की आवश्यकता हो सकती है. इसके अलावा, अधिक क्लोन पूरी नॉकआउट की पहचान करने के क्रम में जांच करने की आवश्यकता हो सकती है। महत्वपूर्ण बात यह है कि यह दिखाया गया है कि प्रवर्धित जीनोमिक क्षेत्रों में लक्ष्यीकरण, विशेष रूप से संरचनात्मक पुनर्व्यवस्थाओं के कारण, कैंसर कोशिकाओं में जीन-स्वतंत्र एंटीप्रोलाइफल प्रतिक्रियाओं को ट्रिगर कर सकता है, जिससे जीन में झूठे सकारात्मक परिणाम हो सकते हैं कार्यात्मक अध्ययन68,69,70. इस संबंध में, आरएनए हस्तक्षेप (आरएनएई) नॉकडाउन और/या सीडीएनए ओवरएक्सप्रेशन जैसे वैकल्पिक दृष्टिकोणों को CRISPR निष्कर्षों को सत्यापित करने के लिए नियोजित किया जाना चाहिए। इसके अलावा, कई सेल लाइनों सेल लाइन विशेष लेकिन जीन स्वतंत्र CRISPR संपादन प्रभाव की गलत व्याख्या से बचने के लिए इस्तेमाल किया जाना चाहिए.
CRISPR/Cas9 प्रणाली जीनोम संपादन के लिए एक सरल और कुशल साधन प्रदान करके बुनियादी और अनुवाद अनुसंधान में क्रांति ला दी है. यहाँ हम CRISPR/Cas9 का उपयोग करने में आसानी का प्रदर्शन करने के लिए एक कैंसर सेल लाइन में ट्रांसक्रिप्शनल अध्ययन के लिए एक intronic silencer बाधित. इस तकनीक के डीएनए स्तर पर CREs के अध्ययन के लिए अनुमति देता है और अंतर्जात संदर्भ में CRE कार्यों की जांच करने के अवसर प्रदान करता है बजाय पारंपरिक विषमगुण रिपोर्टर जीन. हाल ही में, एक CRISPR आधारित आरएनए संपादन प्रणाली भी71 की पहचान की गई है और नियामक तत्वों से लिखित आरएनए को लक्षित करके सीआरई का अध्ययन करने के लिए एक उपन्यास उपकरण के रूप में काम कर सकते हैं। गुणसूत्र रचना पर कब्जा तकनीक के साथ संयोजन करके, CRISPR/Cas9 निश्चित रूप से बदल जीनोम संगठन और जीन अभिव्यक्ति विभिन्न स्वास्थ्य समस्याओं से जुड़े में CREs की भागीदारी को समझने में मदद मिलेगी.
The authors have nothing to disclose.
लेखकों OCI-AML3 सेल लाइन प्रदान करने के लिए प्रो एमडी Minden (प्रिंस मार्गरेट कैंसर सेंटर, विश्वविद्यालय स्वास्थ्य नेटवर्क, टोरंटो, कनाडा) का शुक्रिया अदा करना चाहते हैं. इसके अलावा, लेखक इस शोध के समर्थन में सुविधाएं और सहायता प्रदान करने के लिए कैंसर जीनोमिक्स और पैथोबायोलॉजी (चीनी विश्वविद्यालय हांगकांग) की कोर उपयोगिताएँ धन्यवाद देना चाहूंगा।
0.2 cm-gap electroporation cuvette | Bio-Rad | 1652086 | |
1×TE buffer, pH7.5 | Integrated DNA Technologies | 11-01-02-02 | |
10mM dNTP mix | Thermo Fisher Scientific | 18427013 | |
3500 Genetic Analyzer | Thermo Fisher Scientific | 4405673 | |
6-FAM-labeled fluorescent PCR forward primer | Thermo Fisher Scientific | None | |
7300 Real-Time PCR System | Thermo Fisher Scientific | None | |
7300 System SDS Software | Thermo Fisher Scientific | None | Version 1.3.1 |
Bio-Rad Gene Pulser Xcell system | Bio-Rad | 1652660 | |
ChargeSwitch Direct gDNA Purification Kit, 96-well | Thermo Fisher Scientific | CS11205 | |
crRNA-1 | Integrated DNA Technologies | Alt-R CRISPR-Cas9 crRNA | Components of the Cas9/gRNA complex |
crRNA-2 | Integrated DNA Technologies | Alt-R CRISPR-Cas9 crRNA | Components of the Cas9/gRNA complex |
Deionized formamide | Thermo Fisher Scientific | 4311320 | |
Electroporation Enhancer | Integrated DNA Technologies | 1075915 | |
fetal bovine serum | Thermo Fisher Scientific | 10270098 | |
Fluorometer | Thermo Fisher Scientific | Q32857 | |
GeneMapper Software 5 | Thermo Fisher Scientific | 4475073 | |
GeneScan 600 LIZ Size Standard | Thermo Fisher Scientific | 4408399 | |
GlutaMAX | Thermo Fisher Scientific | 35050061 | |
PBS, 10X Solution, pH7.4 | Affymetrix | 75889 | |
Penicillin and streptomycin | Thermo Fisher Scientific | 15140122 | |
Platinum Taq DNA Polymerase High Fidelity | Thermo Fisher Scientific | 11304029 | |
Qubit dsDNA HS Assay Kit | Thermo Fisher Scientific | Q32854 | |
Recombinant S. pyogenes Cas9 nuclease | Integrated DNA Technologies | 1081058 | Components of the Cas9/gRNA complex |
RPMI 1640 medium | Thermo Fisher Scientific | 31800-022 | |
RPMI 1640 medium without phenol red | Thermo Fisher Scientific | 11835030 | |
RUNX1a TaqMan gene expression assays | Thermo Fisher Scientific | 4331182 | Hs04186042_m1 |
RUNX1b/c TaqMan gene expression assays | Thermo Fisher Scientific | 4331182 | Hs00231079_m1 |
RUNX1c TaqMan gene expression assays | Thermo Fisher Scientific | 4331182 | Hs01021966_m1 |
SuperScript III First-Strand Synthesis System | Thermo Fisher Scientific | 18080051 | |
TaqMan Universal PCR Master Mix | Thermo Fisher Scientific | 4304437 | |
tracrRNA | Integrated DNA Technologies | 1072533 | Components of the Cas9/gRNA complex |
TRIzol Reagent | Thermo Fisher Scientific | 15596018 | |
Unlabeled PCR reverse primer | Thermo Fisher Scientific | None |