抗疟药的紫外线-Vis和裸眼测定优化的格里斯反应
Summary
该协议描述了一种在合成尿液和人血清中检测抗疟原药（PMQ）的新型色度测定方法。
Abstract
Primaquine（PMQ）是一种重要的抗疟疾药物，已被世界卫生组织（WHO）推荐用于治疗由P.vivax和椭圆形引起的威胁生命的感染。然而，PMQ有不必要的副作用，导致葡萄糖-6-磷酸脱氢酶（G6PD）缺乏的患者急性溶血。有必要开发简单可靠的方法来PMQ测定与剂量监测的目的。2019 年初，我们报告了基于 UV-Vis 和肉眼的 PMQ 色度定量方法。检测基于PMQ和ailines之间的格里斯状反应，可以产生有色偶氮产物。合成尿中直接测量PMQ的检测限值在纳米摩尔范围内。此外，该方法在临床相关浓度下，从人血清样本中定量PMQ具有巨大潜力。在本协议中，我们将介绍有关彩色偶氮产物的合成和表征、试剂制备以及PMQ测定程序的技术细节。
Introduction
PMQ是最重要的抗疟药物之一，它不仅作为组织分裂剂，以防止复发，而且作为一种药物细胞杀菌剂，以阻断疾病传播1，2，3，4。血管内溶酶是PMQ的一个引起关注的副作用，在G6PD缺陷中变得极其严重。众所周知，G6PD遗传性疾病在全世界分布，在疟疾流行地区的基因频率在3-30%之间。PMQ弱度的严重程度取决于G6PD缺乏的程度，以及PMQ暴露5、6的剂量和持续时间。为了降低风险，世卫组织建议对疟疾进行单低剂量（0.25毫克基础/千克）PMQ治疗。然而，这仍然受到患者药物敏感性变化5，7的挑战。剂量监测是必要的，以评估PMQ施用后的药代动力学，这可以影响剂量调整，以有限的毒性成功治疗。
高性能液相色谱（HPLC）是PMQ临床测定应用最广泛的技术。Endoh等人报告了一个HPLC系统，该系统带有一个紫外线检测器，用于使用C-18聚合物凝胶柱8进行血清PMQ定量。在其系统中，血清蛋白首先与醋酸酯沉淀，然后将上清液中的PMQ分离为HPLC。校准曲线在浓度范围为0.01-1.0 μg/mL8为线性。另一种基于反相HPLC的方法，在254nm处进行紫外线检测，用于PMQ及其主要代谢物9的定量。PMQ 的校准曲线在 0.025-100 μg/mL 之间是线性的。一种以混合己氧和乙酸乙酯作为有机相的附加液体-液体萃取物用于PMQ分离，回收率达到89%9。最近，Miranda等人开发了一种在260nm处进行紫外线检测的UPLC方法，用于在片剂配方中进行PMQ分析，检测限值为3微克/mL10。
虽然HPLC方法在药物测定中表现出良好的灵敏度，如果HPLC配备质谱仪，灵敏度还可以进一步提高，但仍存在一些缺点。HPLC 通常无法对生物流体中的直接药物测量进行直接测量，因为许多生物分子可以极大地影响分析。在HPLC分析11、12之前，需要额外提取以去除内源性分子。此外，HPLC-UV 探测器的 PMQ 检测通常以最大吸收波长 （260 nm） 进行;然而，生物流体中有许多内源性分子，其吸收性强于260nm（例如氨基酸、维生素、核酸和泌尿色素），从而干扰PMQ紫外线检测。需要开发简单且具有成本效益的方法来确定 PMQ，具有合理的灵敏度和选择性。
格里斯反应最早于1879年作为亚硝酸盐检测13、14、15、16的色度测试。最近，这种反应被广泛探索，不仅检测亚硝酸盐，而且检测其他与生物有关的分子17，18，19，20。我们之前已经报告了对PMQ的意外格里斯反应的第一次系统研究（图1）。在此系统中，PMQ 能够在酸性条件下与亚硝酸盐离子的替代品结合时形成彩色偶氮。我们进一步发现，当增加在苯二1的代用物的电子捐赠效果时，偶氮的颜色从黄色到蓝色不等。通过4-二聚氧碱和PMQ之间的优化反应，开发了一种基于紫外线吸收的PMQ定量方法。该方法在生物相关流体中对PMQ进行敏感和选择性检测具有巨大潜力。在这里，我们旨在描述基于此色度策略的 PMQ 确定的详细过程。
Protocol
Representative Results
Discussion
我们描述了一种用于方便PMQ定量的色度方法。它可能是最简单、最经济高效的当前方法。更重要的是，这种方法无需使用任何设备即可实现基于肉眼的PMQ测量。
用于 PMQ 检测的优化的 Griess 反应可以生成最大吸收为 504 nm 的红色偶氮。内源性生物分子的紫外线吸收的潜在影响有限，因此该方法可用于生物流体中PMQ的直接测量。结果表明，在0-200μM浓度范围内，尿液PMQ检测存在优…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
作者认可了广州中医药大学的创业助学金和GZUCM（2019QNPY06）的青年科研培训项目。我们亦感谢广州中医药大学岭南医学研究中心对设施的支持。
Materials
| 4-Methoxyaniline | Aladdin | K1709027 | |
| 2,4-Dimethoxyaniline | Heowns | 10154207 | |
| 3,4-Dimethoxyaniline | Bidepharm | BD21914 | |
| 4-Methylaniline | Adamas-beta | P1414526 | |
| 4-Nitroaniline | Macklin | C10191447 | |
| 96-wells,Flat Botton | Labserv | 310109008 | |
| Gaussian@16 software | Gaussian, Inc | Version:x86-64 SSE4_2-enabled/Linux | |
| Hydrochloric acid | GCRF | 20180902 | |
| Marvin sketch (software) | CHEMAXON | free edition: 15.6.29 | |
| Phosphoric acid | Macklin | C10112815 | |
| Primaquine bisiphosphate | 3A Chemicals | CEBK200054 | |
| Sodium nitrite | Alfa Aesar | 5006K18R | |
| Sulfonamides | TCI(shanghai) | GCPLO-BP | |
| Varioskan LUX Plate reader | Thermo Fisher | Supplied with SkanIt Software 4.1 |
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