Reação aperfeiçoada de Griess para a determinação UV-VIS e nu-olho do Primaquine anti-malarial
Summary
Este protocolo descreve um método colorimétrico novo para a deteção antimaláricos do primaquina (pmq) em urinas sintéticos e em serums humanos.
Abstract
A primaquina (PMQ), uma importante droga antimalarial, tem sido recomendada pela Organização Mundial de saúde (OMS) para o tratamento de infecções que ameaçam a vida causadas por P. vivax e ovale. No entanto, o PMQ tem efeitos adversos indesejados que levam à hemólise aguda em pacientes com deficiência de glicose-6-fosfato desidrogenase (G6PD). Há uma necessidade de desenvolver métodos simples e confiáveis para a determinação do PMQ com o objetivo de monitoramento de dosagem. No início de 2019, temos relatado uma abordagem baseada em UV-VIS e olho nu para quantificação colorimétrica PMQ. A detecção foi baseada em uma reação de Griess-like entre o PMQ e as anilinas, que podem gerar produtos azo coloridos. O limite de detecção para a medição direta de PMQ em urina sintética está na faixa de nanomolar. Além disso, este método mostrou o grande potencial para a quantificação de PMQ das amostras humanas do soro em concentrações clìnica relevantes. Neste protocolo, descreveremos os detalhes técnicos sobre as sínteses e caracterização de produtos azo coloridos, a preparação do reagente e os procedimentos para determinação do PMQ.
Introduction
O pmq é uma das mais importantes drogas antimaláricas, ele funciona não apenas como um schizontocida tecidual para prevenir a recidiva, mas também como um gametocitocide para interromper a transmissão da doença1,2,3,4. A hemólise intravascular é um dos efeitos colaterais relacionados ao PMQ, que se torna extremamente grave naqueles deficientes em G6PD. Sabe-se que a desordem genética de G6PD é distribuída no mundo inteiro com uma freqüência do gene entre 3-30% em áreas endêmicas da malária. A gravidade da fraqueza do pmq depende do grau de deficiência de G6PD, bem como da dose e da duração da exposição ao pmq5,6. Para reduzir o risco, a OMS recomendou uma dose única baixa (0,25 mg base/kg) de PMQ para o tratamento da malária. No entanto, isso ainda é desafiado pelas variações na sensibilidade do fármaco do paciente5,7. A monitorização da dose é necessária para avaliar a farmacocinética após a administração de PMQ, que pode efetuar o ajuste posológico para um tratamento bem-sucedido com toxicidade limitada.
A cromatografia líquida de alta eficiência (HPLC) é a técnica mais utilizada para a determinação clínica do PMQ. Endoh et al. relataram um sistema de HPLC com detector de UV para quantificação sérica de PMQ usando uma coluna de gel de polímero C-188. Em seu sistema, as proteínas do soro foram precipitadas primeiramente com acetonitrile, e então o PMQ no sobrenadante foi separado para a HPLC. A curva de calibração foi linear sobre a faixa de concentração de 0,01-1,0 μg/mL8. Outro método baseado em uma HPLC de fase reversa com detecção de UV a 254 nm foi relatado para a quantificação de PMQ e seus principais metabólitos9. A curva de calibração para PMQ foi linear na faixa entre 0,025-100 μg/mL. Uma extração líquida-líquida adicional com hexano misto e acetato de etila como fase orgânica foi utilizada para a separação do PMQ com recuperação percentual alcançada para 89%9. Mais recentemente, Miranda et al. desenvolveram um método UPLC com detecção de UV a 260 nm para análise de PMQ em formulações de comprimidos com limite de detecção a 3 μg/mL10.
Embora os métodos da HPLC apresentem a sensibilidade prometedora na determinação da droga e a sensibilidade pode mais ser melhorada se o HPLC é equipado com um espectrómetro maciço, há ainda algumas desvantagens. As medidas diretas da droga em líquidos biológicos são geralmente inacessíveis pela HPLC, desde que muitas biomoléculas podem extremamente influenciar a análise. Extrações adicionais são necessárias para remover moléculas endógenas antes daanálise de HPLC11,12. Além disso, a deteção de PMQ por um detector HPLC-UV é executada tipicamente em seu comprimento de onda máximo da absorção (260 nanômetro).; no entanto, existem muitas moléculas endógenas em fluidos biológicos com uma forte absorvência a 260 nm (por exemplo, aminoácidos, vitaminas, ácidos nucleicos e pigmentos urocromo), interferindo assim com a detecção de UV do PMQ. Há a necessidade de desenvolver métodos simples e rentáveis para a determinação do PMQ com sensibilidade e seletividade razoáveis.
A reação de Griess foi apresentada pela primeira vez em 1879 como um teste colorimétrico para a detecção de nitrito13,14,15,16. Recentemente, esta reação tem sido extensivamente explorada para detectar não só nitrito, mas também outras moléculas biologicamente relevantes17,18,19,20. Nós temos relatado previamente o primeiro estudo sistemático de uma reação inesperada de Griess com PMQ (Figura 1). Neste sistema, o pmq é capaz de formar e coloridos quando acoplado com anilinas substituídas na presença de íons nitrito condições ácidas. Descobrimos ainda que a cor dos e variou de amarelo a azul ao aumentar o efeito de doação de elétrons do substituente nas anilinas21. Um método colorimétrico baseado na absorção UV-VIS para a quantificação de PMQ foi desenvolvido com a reação aperfeiçoada entre o 4-methoxyaniline e o PMQ. Este método demonstrou grande potencial para detecção sensível e seletiva de PMQ em fluidos biorelevantes. Aqui, pretendemos descrever os procedimentos detalhados para a determinação do PMQ com base nessa estratégia colorimétrica.
Protocol
Representative Results
Discussion
Nós descrevemos um método colorimétrico para a quantificação conveniente de PMQ. É potencialmente o método de corrente mais simples e rentável. Mais importante, este método oferece permite a medição de PMQ com base no olho nu sem usar nenhum equipamento.
A reação aperfeiçoada de Griess para a deteção de PMQ pode gerar um azo da cor vermelha com uma absorção máxima em 504 nanômetro. A influência potencial da absorção UV-VIS de biomoléculas endógenas é limitada, fazendo…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Os autores reconhecem a concessão do start-up da Universidade de Guangzhou da medicina chinesa e do projeto de treinamento da pesquisa científica da juventude de GZUCM (2019QNPY06). Nós igualmente reconhecemos o centro médico da pesquisa de Lingnan da Universidade de Guangzhou da medicina chinesa para o apoio em facilidades.
Materials
| 4-Methoxyaniline | Aladdin | K1709027 | |
| 2,4-Dimethoxyaniline | Heowns | 10154207 | |
| 3,4-Dimethoxyaniline | Bidepharm | BD21914 | |
| 4-Methylaniline | Adamas-beta | P1414526 | |
| 4-Nitroaniline | Macklin | C10191447 | |
| 96-wells,Flat Botton | Labserv | 310109008 | |
| Gaussian@16 software | Gaussian, Inc | Version:x86-64 SSE4_2-enabled/Linux | |
| Hydrochloric acid | GCRF | 20180902 | |
| Marvin sketch (software) | CHEMAXON | free edition: 15.6.29 | |
| Phosphoric acid | Macklin | C10112815 | |
| Primaquine bisiphosphate | 3A Chemicals | CEBK200054 | |
| Sodium nitrite | Alfa Aesar | 5006K18R | |
| Sulfonamides | TCI(shanghai) | GCPLO-BP | |
| Varioskan LUX Plate reader | Thermo Fisher | Supplied with SkanIt Software 4.1 |
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