Immunohistochemische test voor de detectie van het lyssavirusantigeen uit formaline-gefixeerde weefsels
Summary
Hier presenteren we een immunohistochemisch testprotocol voor de detectie van rabiësvirusantigeen als een alternatieve diagnostische test voor formaline-gefixeerde weefsels.
Abstract
Een van de primaire diagnostische modaliteiten voor hondsdolheid is de detectie van viraal ribonucleoproteïne (RNP) complex (antigeen) in de geïnfecteerde weefselmonsters. Hoewel de direct fluorescerende antilichaam (DFA) -test of de directe snelle immunohistochemische test (DRIT) het meest worden gebruikt voor de antigeendetectie, vereisen beide tests verse en / of bevroren weefsels voor afdrukken op dia’s voorafgaand aan de antigeendetectie met behulp van antilichamen. Als monsters worden verzameld en gefixeerd in formaline, is geen van beide tests optimaal voor de antigeendetectie, maar testen kunnen worden uitgevoerd door conventionele immunohistochemie (IHC) na inbedding in paraffineblokken en secties. Met deze IHC-methode worden weefsels gekleurd met anti-rabiësantistoffen, secties worden gedeparaffineerd, antigeen opgehaald door gedeeltelijke proteolyse of andere methoden en geïncubeerd met primaire en secundaire antilichamen. Antigenen worden gekleurd met mierikswortelperoxidase / amino-ethylcarbide en counterstained met hematoxyline voor de visualisatie met behulp van een lichtmicroscoop. Naast de specifieke antigeendetectie biedt formalinefixatie andere voordelen, zoals de bepaling van histologische veranderingen, ontspannen omstandigheden voor monsteropslag en -transport (onder omgevingstemperaturen), de mogelijkheid om retrospectieve gevallen te testen en verbeterde biologische veiligheid door de inactivatie van infectieuze agentia.
Introduction
Rabiës is een acute progressieve encefalitis veroorzaakt door de negatieve zin RNA-virussen die behoren tot het geslacht lyssavirus1. Bijna 99% van alle menselijke sterfgevallen veroorzaakt door de infectie met rabiësvirus (RABV), het type lid van het geslacht, wordt overgedragen door honden2. Rabiësdiagnose van verdachte dieren is gebaseerd op de detectie van antigeen (voornamelijk viraal gecodeerd nucleoproteïne, N-eiwit) in complex met genomisch RNA (ribonucleoproteïnecomplex, RNP) in het hersenweefsel3. De antigeendetectie door de direct fluorescerende antilichaam (DFA) -test wordt beschouwd als de gouden standaard voor de diagnose van hondsdolheid4. De methode maakt gebruik van vers of vers bevroren hersenmateriaal, een aanraakimpressie op een dia, fixatie in aceton, kleuring met behulp van in de handel verkrijgbare fluorescerende isothiocyanaat (FITC) gelabelde monoklonale of polyklonale antilichamen (mAbs / pAbs) en gelezen door de fluorescentiemicroscopie5. De DFA-test is snel, gevoelig en specifiek voor rabiës-antigeendetectie in vers hersenweefsel. Onlangs werd aangetoond dat een directe snelle immunohistochemische test (DRIT), gemodificeerde immunohistochemie (IHC) -techniek, een vergelijkbare gevoeligheid vertoont voor DFA, maar biedt het voordeel van lichtmicroscopie voor visualisatie6. Hoewel de detectiemethode die in DRIT wordt gebruikt, vergelijkbaar is met IHC, maakt de eerste stap gebruik van verse of bevroren weefsels om aanraakafdrukken van het monster te genereren, gevolgd door fixatie in formaline.
IHC is een veelgebruikte techniek om histologische veranderingen en detectie van eiwitten te bepalen met behulp van specifieke antilichamen in formaline-gefixeerde weefsels ingebed in paraffineblokken. IHC is een gevestigde alternatieve test voor de detectie van rabiësantigeen in de weefselsecties7. IHC is met name gebruikt voor de diagnose van retrospectieve gevallen die neurologische ziekten vertoonden om de last van hondsdolheid te bepalen8. Paraffine-ingebedde formaline-gefixeerde weefsels behouden de eiwitten voor de detectie, zelfs na enkele jaren wanneer ze bij omgevingstemperatuur worden bewaard9. Formalinebehandeling wijzigt eiwitten door de aminozuurzijketens te verknopen en te veranderen, waardoor de epitopen mogelijk niet langer reactief zijn tegen antilichamen10. Hoewel de IHC-test voor rabiës-antigeendetectie mAbs of pAbs omvat, is de laatste voordelig omdat meerdere epitopen en divergente lyssavirussen kunnen worden gedetecteerd11.
De standaardstappen die betrokken zijn bij IHC zijn formalinefixatie van weefsels, inbedding in paraffineblokken, sectie van weefsels, deparaffinisatie en hydratatie, epitoopherstel, reactiviteit tegen primaire en secundaire antilichamen en de ontwikkeling met behulp van chromogene substraten. Dit manuscript beschrijft een gedetailleerd verslag van het protocol voor de diagnose van hondsdolheid. Voor de detectie van rabiësantigeen worden muizenserum geïmmuniseerd met RABV (pAbs) gegenereerd bij de Amerikaanse Centers for Disease Control and Prevention (CDC) Atlanta, Georgia, in combinatie met gebiotinyleerde antimuis secundaire antilichamen gebruikt. Gebiotinyleerde abs worden gedetecteerd door de toevoeging van streptavidin-mierikswortelperoxidase (HRP) -complex gevolgd door de kleurontwikkeling met amino-ethylcarbazolsubstraat.
Protocol
Representative Results
Discussion
Vanwege het hoge sterftecijfer van hondsdolheid na het begin van de symptomen, is de diagnose van verdachte dieren voor RABV-infectie uiterst kritisch voor een geschikte profylactische behandeling na blootstelling. De diagnose van hondsdolheid hangt voornamelijk af van DFA-, DRIT- en PCR-gebaseerde technieken met behulp van verse of bevroren weefsels. Voor het testen van formaline-gefixeerde weefsels biedt de IHC-test een alternatieve methode voor de gevoelige en specifieke detectie van RABV-antigeen. Terwijl de weefsels…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
We bedanken de laboratoria, epidemiologen en gelieerde ondernemingen met volksgezondheidsafdelingen voor het indienen van monsters bij de Centers for Disease Control and Prevention. De bevindingen en conclusies in dit rapport zijn die van de auteurs en vertegenwoordigen niet noodzakelijkerwijs het officiële standpunt van de Centers for Disease Control and Prevention. Het gebruik van handelsnamen en commerciële bronnen is alleen voor identificatie en impliceert geen goedkeuring door de Centers for Disease Control and Prevention.
Materials
| 3% hydrogen peroxide | Pharamacy brands | Off the shelf 3% H2O2 | |
| 3-Amino-9-ethylcarbazole (AEC) | Millipore Sigma | A6926 | |
| Acetate Buffer pH 5.2 | Poly Scientific R&D Corp. | s140 | |
| Buffered Formalin 10% Phosphate Buffered | Fisher Scientific | SF100-4 | Certified |
| Cover slips Corning | Fisher Scientific | 12-553-471 | 24 X 50 mm |
| Ethanol 190 Proof | Pharmco-AAPER | 111000190 | |
| Ethanol 200 Proof | Pharmco-AAPER | 111000200 | |
| Gill's hematoxylin formulation #2 | Fisher Scientific | CS401-1D | |
| HistoMark Biotin-Streptavidin Peroxidase Kit | seracare | 71-00-18 | Mouse Primary Antibody |
| ImmunoHistoMount | Millipore Sigma | i1161 | Mounting media |
| N,N, Dimethyl formamide GR | Fisher Scientific | D119 | |
| Phosphate Buffered Saline | HyClone | RR14440.01 | 01M, pH 7.2 (pH 7.2-7.6) |
| Plan-APOCHROMAT 40X/0.95 Objective | Multiple vendors | ||
| Plan-APOCHROMATIC 20X/0.75 Objective | Multiple vendors | ||
| Pronase | Millipore Sigma | 53702 | Protease, Streptomyces griseus |
| Scott's Tap Water | Poly Scientific R&D Corp. | s1887 | |
| Tissue-Tek Slide stain set | Fisher Scientific | 50-294-72 | |
| TWEEN-80 | Millipore Sigma | P1754 | |
| Xylene | Fisher Scientific | X3S-4 | Histological Grade |
| Zeiss Axioplan 2 imaging – microscope | Multiple vendors |
References
- Rupprecht, C., Kuzmin, I., Meslin, F. Lyssaviruses and rabies: current conundrums, concerns, contradictions and controversies. F1000Research. 6, 184 (2017).
- Fooks, A. R., et al. Current status of rabies and prospects for elimination. Lancet. 384 (9951), 1389-1399 (2014).
- Finke, S., Brzozka, K., Conzelmann, K. K. Tracking fluorescence-labeled rabies virus: enhanced green fluorescent protein-tagged phosphoprotein P supports virus gene expression and formation of infectious particles. Journal of Virology. 78 (22), 12333-12343 (2004).
- WHO. WHO Expert Consulation on Rabies, Third Report. WHO Technical Report Series. 1012, 1 (2018).
- Goldwasser, R. A., Kissling, R. E. Fluorescent antibody staining of street and fixed rabies virus antigens. Proceedings of the Society for Experimental Biology and Medicine. 98 (2), 219-223 (1958).
- Lembo, T., et al. Evaluation of a direct, rapid immunohistochemical test for rabies diagnosis. Emerging Infectious Diseases. 12 (2), 310-313 (2006).
- Fekadu, M., Greer, P. W., Chandler, F. W., Sanderlin, D. W. Use of the avidin-biotin peroxidase system to detect rabies antigen in formalin-fixed paraffin-embedded tissues. Journal of Virological Methods. 19 (2), 91-96 (1988).
- Hamir, A. N., Moser, G., Rupprecht, C. E. A five year (1985-1989) retrospective study of equine neurological diseases with special reference to rabies. Journal of Comparative Pathology. 106 (4), 411-421 (1992).
- Inoue, S., et al. Cross-reactive antigenicity of nucleoproteins of lyssaviruses recognized by a monospecific antirabies virus nucleoprotein antiserum on paraffin sections of formalin-fixed tissues. Pathology International. 53 (8), 525-533 (2003).
- Webster, J. D., Miller, M. A., Dusold, D., Ramos-Vara, J. Effects of prolonged formalin fixation on diagnostic immunohistochemistry in domestic animals. Journal of Histochemistry and Cytochemistry. 57 (8), 753-761 (2009).
- Feiden, W., et al. Immunohistochemical staining of rabies virus antigen with monoclonal and polyclonal antibodies in paraffin tissue sections. Zentralblatt fur Veterinarmedizin Reihe B. 35 (4), 247-255 (1988).
- Manning, S. E., et al. Human rabies prevention–United States, 2008: recommendations of the Advisory Committee on Immunization Practices. Morbidity and Mortality Weekly Reports Recommendations and Reports. 57, 1-28 (2008).
- WHO. . Laboratory techniques in rabies. 1, 67-72 (2018).
- Patrick, E. M., et al. Enhanced Rabies Surveillance Using a Direct Rapid Immunohistochemical Test. Journal of Visualized Experiments. (146), (2019).
- Whitfield, S. G., et al. A comparative study of the fluorescent antibody test for rabies diagnosis in fresh and formalin-fixed brain tissue specimens. Journal of Virology Methods. 95 (1-2), 145-151 (2001).
- WHO. . Diagnostic procedures for antigen detection. , (2016).
- Jarvis, J. A., Franke, M. A., Davis, A. D. Rabies direct fluorescent antibody test does not inactivate rabies or eastern equine encephalitis viruses. Journal of Virology Methods. 234, 52-53 (2016).
