Immunohistokemitest för lyssavirusantigendetektering från formalin-fasta vävnader
Summary
Här presenterar vi ett immunohistokemi testprotokoll för påvisande av rabies virus antigen som ett alternativt diagnostiskt test för formalin-fasta vävnader.
Abstract
En av de primära diagnostiska metoderna för rabies är påvisande av viral ribonukleoprotein (RNP) komplexa (antigen) i de infekterade vävnadsproverna. Medan det direkta fluorescerande antikroppstestet (DFA) eller det direkta snabba immunohistokemiska testet (DRIT) oftast används för antigendetektion, kräver båda testerna färska och/eller frysta vävnader för intryck på diabilder före antigendetektionen med antikroppar. Om prover samlas in och fixeras i formalin är inget av testerna optimalt för antigendetektion, men testning kan utföras av konventionell immunohistokemi (IHC) efter inbäddning i paraffinblock och sektionering. Med denna IHC-metod färgas vävnader med anti-rabies antikroppar, avsnitt är deparaffiniserade, antigen hämtas genom partiell proteolys eller andra metoder och inkuberas med primära och sekundära antikroppar. Antigener färgas med pepparrot peroxidas / amino etylkarbazol och kontrastained med hematoxylin för visualisering med hjälp av ett lätt mikroskop. Utöver den specifika antigendetektion erbjuder formalinfixering andra fördelar som bestämning av histologiska förändringar, avslappnade förhållanden för lagring och transport av prover (under omgivningstemperatur), förmåga att testa retrospektiva fall och förbättrad biologisk säkerhet genom inaktivering av smittämnen.
Introduction
Rabies är en akut progressiv encefalit orsakad av den negativa känslan RNA-virus som tillhör släktet lyssavirus1. Nästan 99% av alla mänskliga dödsfall orsakade av infektionen med rabiesvirus (RABV), typmedlemmen av släktet, överförs av hundar2. Rabies diagnos av misstänkta djur förlitar sig på påvisande av antigen (främst viral kodade nukleoprotein, N protein) i komplex med genomisk RNA (ribonukleoprotein komplex, RNP) ihjärnvävnaden 3. Antigen detektion av direkt fluorescerande antikroppar (DFA) test anses vara guld standard för rabies diagnos4. Metoden använder färskt eller färskt fruset hjärnmaterial, ett beröringsintryck på en glidning, fixering i aceton, färgning med kommersiellt tillgängligt fluorescerande isothiocyanat (FITC) märkt monoklonal eller polyklonal antikropp (mAbs/ pAbs) och läst av fluorescensmikroskopi5. DFA-testet är snabbt, känsligt och specifikt för rabiesantigendetektering i färsk hjärnvävnad. Nyligen visades ett direkt snabbt immunohistokemiskt test (DRIT), modifierad immunohistokemi (IHC) teknik, uppvisa liknande känslighet som DFA men erbjuder fördelen med ljusmikroskopi för visualisering6. Medan detektionsmetoden som används i DRIT liknar IHC, använder det första steget färska eller frysta vävnader för att generera beröringsintryck av provet följt av fixering i formalin.
IHC är en allmänt använd teknik för att bestämma histologiska förändringar och detektion av proteiner med hjälp av specifika antikroppar i formalin-fasta vävnader inbäddade i paraffinblock. IHC är ett fastställt alternativt test för rabiesantigendetektion i vävnadssektionerna7. IHC har använts särskilt för diagnos av retrospektiva fall som uppvisade neurologiska sjukdomar för att bestämma bördan av rabies8. Paraffin-inbäddade formalin-fasta vävnader bevarar proteinerna för detektion även efter flera år när de lagras vid omgivningstemperatur9. Formalinbehandling ändrar proteiner genom att korslänka och ändra aminosyran sidokedjor, vilket kan göra epitoperna inte längre reaktiva mot antikroppar10. Medan IHC-testet för rabies antigen detektion involverar antingen mAbs eller pAbs, den senare är fördelaktig eftersom flera epitoper och divergerande lyssavirus kan detekteras11.
De standardsteg som är involverade i IHC är formalin fixering av vävnader, inbäddning i paraffinblock, sektionering av vävnader, deparaffinisering och hydrering, epitopåterhämtning, reaktivitet mot primära och sekundära antikroppar och utveckling med kromogena substrat. Detta manuskript beskriver en detaljerad redogörelse för protokollet för rabies diagnos. För rabies antigen detektion, mus serum immuniseras med RABV (pAbs) genereras vid U.S. Centers for Disease Control and Prevention (CDC) Atlanta, Georgia, i kombination med biotinylerade anti-mouse sekundära antikroppar används. Biotinylerade abs detekteras genom tillsats av streptavidin-pepparrot peroxidas (HRP) komplex följt av färgutvecklingen med amino-etylkarbazol substrat.
Protocol
Representative Results
Discussion
På grund av den höga dödstalen av rabies efter symptomet insättande, diagnos av misstänkta djur för RABV infektion är extremt avgörande för en lämplig post-exposure profylaktisk behandling. Rabies diagnos beror främst på DFA, DRIT och PCR-baserade tekniker med färska eller frysta vävnader. För testning av formalin-fasta vävnader ger IHC-testet en alternativ metod för känslig och specifik detektion av RABV-antigen. Medan de vävnader som är fixerade i formalin har proteiner stabiliserade på grund av mo…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Vi tackar arbetarna, epidemiologerna och dotterbolagen till folkhälsoavdelningar för provinlämningar till Centers for Disease Control and Prevention. Resultaten och slutsatserna i denna rapport är författarnas och representerar inte nödvändigtvis den officiella positionen för Centers for Disease Control and Prevention. Användning av handelsnamn och kommersiella källor är endast för identifiering och innebär inte godkännande av Centers for Disease Control and Prevention.
Materials
| 3% hydrogen peroxide | Pharamacy brands | Off the shelf 3% H2O2 | |
| 3-Amino-9-ethylcarbazole (AEC) | Millipore Sigma | A6926 | |
| Acetate Buffer pH 5.2 | Poly Scientific R&D Corp. | s140 | |
| Buffered Formalin 10% Phosphate Buffered | Fisher Scientific | SF100-4 | Certified |
| Cover slips Corning | Fisher Scientific | 12-553-471 | 24 X 50 mm |
| Ethanol 190 Proof | Pharmco-AAPER | 111000190 | |
| Ethanol 200 Proof | Pharmco-AAPER | 111000200 | |
| Gill's hematoxylin formulation #2 | Fisher Scientific | CS401-1D | |
| HistoMark Biotin-Streptavidin Peroxidase Kit | seracare | 71-00-18 | Mouse Primary Antibody |
| ImmunoHistoMount | Millipore Sigma | i1161 | Mounting media |
| N,N, Dimethyl formamide GR | Fisher Scientific | D119 | |
| Phosphate Buffered Saline | HyClone | RR14440.01 | 01M, pH 7.2 (pH 7.2-7.6) |
| Plan-APOCHROMAT 40X/0.95 Objective | Multiple vendors | ||
| Plan-APOCHROMATIC 20X/0.75 Objective | Multiple vendors | ||
| Pronase | Millipore Sigma | 53702 | Protease, Streptomyces griseus |
| Scott's Tap Water | Poly Scientific R&D Corp. | s1887 | |
| Tissue-Tek Slide stain set | Fisher Scientific | 50-294-72 | |
| TWEEN-80 | Millipore Sigma | P1754 | |
| Xylene | Fisher Scientific | X3S-4 | Histological Grade |
| Zeiss Axioplan 2 imaging – microscope | Multiple vendors |
References
- Rupprecht, C., Kuzmin, I., Meslin, F. Lyssaviruses and rabies: current conundrums, concerns, contradictions and controversies. F1000Research. 6, 184 (2017).
- Fooks, A. R., et al. Current status of rabies and prospects for elimination. Lancet. 384 (9951), 1389-1399 (2014).
- Finke, S., Brzozka, K., Conzelmann, K. K. Tracking fluorescence-labeled rabies virus: enhanced green fluorescent protein-tagged phosphoprotein P supports virus gene expression and formation of infectious particles. Journal of Virology. 78 (22), 12333-12343 (2004).
- WHO. WHO Expert Consulation on Rabies, Third Report. WHO Technical Report Series. 1012, 1 (2018).
- Goldwasser, R. A., Kissling, R. E. Fluorescent antibody staining of street and fixed rabies virus antigens. Proceedings of the Society for Experimental Biology and Medicine. 98 (2), 219-223 (1958).
- Lembo, T., et al. Evaluation of a direct, rapid immunohistochemical test for rabies diagnosis. Emerging Infectious Diseases. 12 (2), 310-313 (2006).
- Fekadu, M., Greer, P. W., Chandler, F. W., Sanderlin, D. W. Use of the avidin-biotin peroxidase system to detect rabies antigen in formalin-fixed paraffin-embedded tissues. Journal of Virological Methods. 19 (2), 91-96 (1988).
- Hamir, A. N., Moser, G., Rupprecht, C. E. A five year (1985-1989) retrospective study of equine neurological diseases with special reference to rabies. Journal of Comparative Pathology. 106 (4), 411-421 (1992).
- Inoue, S., et al. Cross-reactive antigenicity of nucleoproteins of lyssaviruses recognized by a monospecific antirabies virus nucleoprotein antiserum on paraffin sections of formalin-fixed tissues. Pathology International. 53 (8), 525-533 (2003).
- Webster, J. D., Miller, M. A., Dusold, D., Ramos-Vara, J. Effects of prolonged formalin fixation on diagnostic immunohistochemistry in domestic animals. Journal of Histochemistry and Cytochemistry. 57 (8), 753-761 (2009).
- Feiden, W., et al. Immunohistochemical staining of rabies virus antigen with monoclonal and polyclonal antibodies in paraffin tissue sections. Zentralblatt fur Veterinarmedizin Reihe B. 35 (4), 247-255 (1988).
- Manning, S. E., et al. Human rabies prevention–United States, 2008: recommendations of the Advisory Committee on Immunization Practices. Morbidity and Mortality Weekly Reports Recommendations and Reports. 57, 1-28 (2008).
- WHO. . Laboratory techniques in rabies. 1, 67-72 (2018).
- Patrick, E. M., et al. Enhanced Rabies Surveillance Using a Direct Rapid Immunohistochemical Test. Journal of Visualized Experiments. (146), (2019).
- Whitfield, S. G., et al. A comparative study of the fluorescent antibody test for rabies diagnosis in fresh and formalin-fixed brain tissue specimens. Journal of Virology Methods. 95 (1-2), 145-151 (2001).
- WHO. . Diagnostic procedures for antigen detection. , (2016).
- Jarvis, J. A., Franke, M. A., Davis, A. D. Rabies direct fluorescent antibody test does not inactivate rabies or eastern equine encephalitis viruses. Journal of Virology Methods. 234, 52-53 (2016).
