Højeffektiv Transfection af primær makrofager med in vitro transkriberet mRNA
Summary
Makrofager, især primær makrofager, er udfordrende at transficere, da de specialiserer sig i at opdage molekyler af ikke-selv oprindelse. Vi beskriver en protokol, der giver mulighed for yderst effektiv transfektering af primær makrofager med mRNA genereret fra DNA-skabeloner som plasmider.
Abstract
Makrofager er fagocytiske celler specialiseret i påvisning af molekyler af ikke-selv oprindelse. Til dette formål er de udstyret med et stort udvalg af mønster genkendelses receptorer (PRRs). Desværre gør dette også makrofager særligt udfordrende at transficere som transfektering reagens og transficeret nukleinsyre syrer er ofte anerkendt af PRRS som non-Self. Transfektering medfører derfor ofte makrofagaktivering og nedbrydning af de transficeret nukleinsyrer eller endog selvmord på makrofager. Her beskriver vi en protokol, der giver mulighed for højeffektiv transfektering af murine primær makrofager såsom peritonealdialyse makrofager (PM) og knoglemarv-afledte makrofager (bmdm) med mRNA in vitro transkriberet fra DNA-skabeloner såsom Plasmids. Med denne enkle protokol opnås transfektering på ca. 50-65% for PM og ca. 85% for bmdm uden cytotoksicitet eller immunogenicitet observeret. Vi beskriver i detaljer den generation af mRNA for transfektering fra DNA-konstruktioner som plasmider og transfektering procedure.
Introduction
Makrofager er fagocytiske celler, der specialiserer sig i påvisning, indtagelse og nedværdigende mikrober, apoptotiske celler og cellulære vragrester. Desuden, de bidrager til at orkestrat immunrespons ved at udskilte cytokiner og kemo okiner og ved at præsentere antigener til T-celler og B-celler. Makrofager spiller også vigtige roller i talrige andre processer, såsom sårheling, åreforkalkning, tumor og fedme.
For at kunne detektere ikke-selv molekylære molekyler, såsom patogen-associerede molekyl mønstre (Pjater) og out-of-Place-molekyler såsom skade relaterede molekylære mønstre (DAMPs), er makrofager udstyret med et stort udvalg af mønster genkendelses receptorer (PRR)1. Desværre gør dette også makrofager særligt udfordrende at transficere2 som transfektering reagens3 og transficeret nukleinsyre syrer4,5,6,7 ofte er anerkendt af PRRS som non-Self. Af denne grund resulterer transfektering af makrophager ved hjælp af kemiske eller fysiske metoder8 sædvanligvis i makrofag aktivering og nedbrydning af de transficeret nukleinsyrer eller endda i makrofag selvmord via pyroptose, en form for programmeret lytisk celledød udløst efter anerkendelse af cytosolisk PAMPs/damps såsom DNA eller udenlandsk RNA9. Biologisk transfektering af makrofager ved hjælp af vira såsom adenoviruser eller lentivira som vektorer er ofte mere effektiv, men opførelsen af sådanne virale vektorer er tidskrævende og kræver biosikkerhedsniveau 2 udstyr10,11.
Selv om makrofager er genstand for intensiv forskning, hæmmes analysen af deres funktioner på molekylær niveau, fordi et af de vigtigste værktøjer i molekylær biologi, transfektering af nukleinsyre konstruktioner til eksogen ekspression af proteiner, er næppe anvendelig. Dette tvinger ofte forskerne til at bruge makrofag-lignende cellelinjer frem for bona fide makrofager. Anvendelser for nukleinsyre konstruktions transfektering omfatter ekspression af muterede eller mærkede protein versioner, overekspression af et specifikt protein, protein genekspression i en respektive knockout baggrund og ekspression af proteiner fra andre arter (f. eks. , CRE rekombinase eller guide RNA og Cas9 til målrettet gen-udskæring).
Her beskriver vi en protokol, der giver mulighed for yderst effektiv transfektering (sædvanligvis svær at transfect) primær makrofager, der er murine peritonealdialyse makrofager (PM) og knoglemarv-afledte makrofager (bmdm) med mRNA genereret fra DNA-skabeloner såsom Plasmids. Vigtigere, den in vitro transkriberet mRNA genereret ved hjælp af denne protokol indeholder de naturligt forekommende modificerede Nukleosider 5-methyl-CTP og pseudo-UTP, der reducerer immunogenicitet og øge stabiliteten4,6,7,12,13. Desuden er 5 ‘-enderne af in vitro transkriberet mRNA defosforyleret af Antarktis fosfatase for at forhindre anerkendelse af riggen-i Complex14,15. Dette minimerer medfødte immun genkendelse af in vitro transkriberet mRNA. Med vores nemme at udføre protokol, er transfektering satser mellem 50-65% (peritoneal makrofager (PM)) og 85% (bmdm) nået, mens, vigtigere, der er ingen cytotoksicitet eller immunogenicitet observeret. Vi beskriver i detaljer (i) hvordan den immunologisk lyddæmpet mRNA for transfektering kan genereres fra DNA-konstruktioner såsom plasmider og (II) selve transfektering procedure.
Protocol
Representative Results
Discussion
Her præsenterer vi en protokol for højeffektiv transfektering af sædvanligvis svære at transfect primære makro fagter med in vitro transkriberet mRNA. Vigtigere, transfektering af makrofager ved hjælp af denne protokol ikke fremkalde celledød eller aktivere proinflammatorisk signalering indikerer, at hverken transfektering reagens eller transficeret mRNA er anerkendt som non-Self.
Mrna’s kvalitet er af afgørende betydning for en vellykket transfektering af makrophages ved hjælp af den…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Dette arbejde blev støttet af Deutsche Forschungsgemeinschaft (SFB 670).
Materials
| 5-methyl-CTP (100 mM) | Jena Biosience | NU-1138S | stored at -20 °C |
| Antarctic phosphatase | New England BioLabs | M0289 | stored at -20 °C |
| Antarctic phosphatase reaction buffer (10X) | New England BioLabs | B0289 | stored at -20 °C |
| anti-NEMO/IKKγ antibody | Invitrogen | MA1-41046 | stored at -20 °C |
| anti-β-actin antibody | Sigma-Aldrich | A2228 | stored at -20 °C |
| Petri dishes 92,16 mm with cams | Sarstedt | 821,473 | stored at RT |
| CD11b Microbeads mouse and human | Miltenyi Biotec | 130-049-601 | stored at 4 °C |
| Cre recombinase + T7-Promotor forward primer | Sigma-Aldrich | 5′-GAAATTAATACGACTCACTATA GGGGCAGCCGCCACCATGTCC AATTTACTGACCGTAC-3´, stored at -20 °C |
|
| Cre recombinase + T7-Promotor reverse primer | Sigma-Aldrich | 5′-CTAATCGCCATCTTCCAGCAGG C-3′, stored at -20 °C |
|
| DNA purification kit: QIAquick PCR purification Kit | Qiagen | 28104 | stored at RT |
| eGFP + T7-Promotor forward primer | Sigma-Aldrich | 5´-GAAATTAATACGACTCACTATA GGGATCCATCGCCACCATGGTG AGCAAGG-3´, stored at -20 °C |
|
| eGFP + T7-Promotor reverse primer | Sigma-Aldrich | 5´-TGGTATGGCTGATTA TGATCTAGAGTCG-3´, stored at -20 °C |
|
| Fast Digest buffer (10X) | Thermo Scientific | B64 | stored at -20 °C |
| FastDigest XbaI | Thermo Scientific | FD0684 | stored at -20 °C |
| high-fidelity polymerase with proofreading: Q5 High-Fidelity DNA-Polymerase | New England Biolabs Inc | M0491S | stored at -20 °C |
| IKKβ + T7-Promotor forward primer | Sigma-Aldrich | 5′-GAAATTAATACGACTCACTATA GGGTTGATCTACCATGGACTACA AAGACG-3′, stored at -20 °C |
|
| IKKβ + T7-Promotor reverse primer | Sigma-Aldrich | 5′-GAGGAAGCGAGAGCT-CCATCTG-3′, stored at -20 °C | |
| in vitro mRNA transcription kit: HiScribe T7 ARCA mRNA kit (with polyA tailing) | New England BioLabs | E2060 | stored at -20 °C |
| LS Columns | Miltenyi Biotec | 130-042-401 | stored at RT |
| MACS MultiStand | Miltenyi Biotec | 130-042-303 | stored at RT |
| mRNA transfection buffer and reagent: jetMESSENGER | Polyplus transfection | 409-0001DE | stored at 4 °C |
| Mutant IKKβ IKK-2S177/181E plasmid | Addgene | 11105 | stored at -20 °C |
| Mutant NEMOC54/347A plasmid | Addgene | 27268 | stored at -20 °C |
| pEGFP-N3 plasmid | Addgene | 62043 | stored at -20 °C |
| poly(I:C) | Calbiochem | 528906 | stored at -20 °C |
| pPGK-Cre plasmid | F. T. Wunderlich, H. Wildner, K. Rajewsky, F. Edenhofer, New variants of inducible Cre recombinase: A novel mutant of Cre-PR fusion protein exhibits enhanced sensitivity and an expanded range of inducibility. Nucleic Acids Res. 29, 47e (2001). stored at -20 °C | ||
| pseudo-UTP (100 mM) | Jena Biosience | NU-1139S | stored at -20 °C |
| QuadroMACS Separator | Miltenyi Biotec | 130-090-976 | stored at RT |
| Rat-anti-mouse CD11b antibody, APC-conjugated | BioLegend | 101212 | stored at 4 °C |
| Rat-anti-mouse F4/80 antibody, PE-conjugated | eBioscience | 12-4801-82 | stored at 4 °C |
| recombinant M-CSF | Peprotech | 315-02 | stored at -20 °C |
| RNA purification kit: MEGAclear transcription clean-up kit | ThermoFisher Scientific | AM1908 | stored at 4 °C |
| RNAse-degrading surfactant: RnaseZAP | Sigma-Aldrich | R2020 | stored at RT |
| ultrapure LPS from E.coli O111:B4 | Invivogen | stored at -20 °C | |
| Wild type IKKβ plasmid | Addgene | 11103 | stored at -20 °C |
| Wild type NEMO plasmid | Addgene | 27268 | stored at -20 °C |
References
- Ley, K., Pramod, A. B., Croft, M., Ravichandran, K. S., Ting, J. P. How Mouse Macrophages Sense What Is Going On. Frontiers in Immunology. 7 (204), (2016).
- Zhang, X., Edwards, J. P., Mosser, D. M. The expression of exogenous genes in macrophages: obstacles and opportunities. Methods in Molecular Biolology. 531, 123-143 (2009).
- Guo, X., et al. Transfection reagent Lipofectamine triggers type I interferon signaling activation in macrophages. Immunology and cell biology. 97 (1), 92-96 (2019).
- Kariko, K., Weissman, D. Naturally occurring nucleoside modifications suppress the immunostimulatory activity of RNA: implication for therapeutic RNA development. Current Opinion in Drug Discovery and Development. 10 (5), 523-532 (2007).
- Van De Parre, T. J., Martinet, W., Schrijvers, D. M., Herman, A. G., De Meyer, G. R. mRNA but not plasmid DNA is efficiently transfected in murine J774A.1 macrophages. Biochemical and biophysical research communications. 327 (1), 356-360 (2005).
- Uchida, S., Kataoka, K., Itaka, K. Screening of mRNA Chemical Modification to Maximize Protein Expression with Reduced Immunogenicity. Pharmaceutics. 7 (3), 137-151 (2015).
- Kariko, K., et al. Incorporation of pseudouridine into mRNA yields superior nonimmunogenic vector with increased translational capacity and biological stability. Molecular Therapy. 16 (11), 1833-1840 (2008).
- Khantakova, J. N., et al. Transfection of bone marrow derived cells with immunoregulatory proteins. Cytokine. 108, 82-88 (2018).
- Franz, K. M., Kagan, J. C. Innate Immune Receptors as Competitive Determinants of Cell Fate. Molecular Cell. 66 (6), 750-760 (2017).
- Kaestner, L., Scholz, A., Lipp, P. Conceptual and technical aspects of transfection and gene delivery. Bioorganic & medicinal chemistry letters. 25 (6), 1171-1176 (2015).
- Kim, T. K., Eberwine, J. H. Mammalian cell transfection: the present and the future. Analytical and Bioanalytical Chemistry. 397 (8), 3173-3178 (2010).
- Kormann, M. S., et al. Expression of therapeutic proteins after delivery of chemically modified mRNA in mice. Nature Biotechnology. 29 (2), 154-157 (2011).
- Kariko, K., Buckstein, M., Ni, H., Weissman, D. Suppression of RNA recognition by Toll-like receptors: the impact of nucleoside modification and the evolutionary origin of RNA. Immunity. 23 (2), 165-175 (2005).
- Hornung, V., et al. 5′-Triphosphate RNA is the ligand for RIG-I. Science. 314 (5801), 994-997 (2006).
- Pichlmair, A., et al. RIG-I-mediated antiviral responses to single-stranded RNA bearing 5′-phosphates. Science. 314 (5801), 997-1001 (2006).
- Herb, M., et al. Mitochondrial reactive oxygen species enable proinflammatory signaling through disulfide linkage of NEMO. Science Signaling. 12 (568), (2019).
- Schmidt-Supprian, M., et al. NEMO/IKK gamma-deficient mice model incontinentia pigmenti. Molecular Cell. 5 (6), 981-992 (2000).
- Mandal, P. K., Rossi, D. J. Reprogramming human fibroblasts to pluripotency using modified mRNA. Nature Protocols. 8 (3), 568-582 (2013).
- Oh, S., Kessler, J. A. Design, Assembly, Production, and Transfection of Synthetic Modified mRNA. Methods. 133, 29-43 (2018).
