Hocheffiziente Transfektion von primärer Makrophagen mit In Vitro transscribed mRNA

Summary

Makrophagen, insbesondere primäre Makrophagen, sind eine Herausforderung zu transfetieren, da sie sich auf die Detektion von Molekülen ohne Selbstherkunft spezialisieren. Wir beschreiben ein Protokoll, das eine hocheffiziente Transfektion von primären Makrophagen mit mRNA ermöglicht, die aus DNA-Vorlagen wie Plasmiden generiert werden.

Abstract

Makrophagen sind phagozytische Zellen, die auf die Detektion von Molekülen ohne Selbstherkunft spezialisiert sind. Zu diesem Zweck sind sie mit einer großen Auswahl an Mustererkennungsrezeptoren (PRRs) ausgestattet. Leider macht dies auch Makrophagen besonders schwierig zu transfekieren, da das Transfektionsreagenz und die transfizierten Nukleinsäuren von den PRRs oft als nicht-selbst erkannt werden. Daher führt die Transfektion oft zu Makrophagenaktivierung und Abbau der transfizierten Nukleinsäuren oder sogar zum Selbstmord der Makrophagen. Hier beschreiben wir ein Protokoll, das eine hocheffiziente Transfektion von murinen primären Makrophagen wie Peritonealmakrophagen (PM) und Knochenmark-abgeleiteten Makrophagen (BMDM) mit mRNA in vitro aus DNA-Vorlagen wie Plasmiden transkribiert ermöglicht. Mit diesem einfachen Protokoll werden Transfektionsraten von etwa 50-65% für PM und etwa 85% für BMDM erreicht, ohne dass Zytotoxizität oder Immunogenität beobachtet werden. Wir beschreiben detailliert die Generierung von mRNA für die Transfektion aus DNA-Konstrukten wie Plasmiden und dem Transfektionsverfahren.

Introduction

Makrophagen sind phagozytische Zellen, die sich auf die Erkennung, Einnahme und Erniedrigung von Mikroben, apoptotischen Zellen und zellulären Ablagerungen spezialisieren. Darüber hinaus helfen sie, Immunantworten zu orchestrieren, indem sie Zytokine und Chemokine sezernieren und Antigene t-Zellen und B-Zellen präsentieren. Makrophagen spielen auch eine wichtige Rolle in zahlreichen anderen Prozessen, wie Wundheilung, Arteriosklerose, Tumorgenese und Adipositas.

Um Nicht-Selbstmoleküle wie pathogenassoziierte molekulare Muster (PAMPs) und außerorts entfernte Moleküle wie schadensassoziierte molekulare Muster (DAMPs) nachweisen zu können, sind Makrophagen mit einer Vielzahl von Mustererkennungsrezeptoren (PRR)^{ausgestattet 1}. Leider macht dies auch Makrophagen besonders schwierig,^{um 2} zu transfekieren, da das Transfektionsreagenz³ und die transfizierten Nukleinsäuren^4,5,6,7 oft von den PRRs als nicht selbst erkannt werden. Aus diesem Grund führt die Transfektion von Makrophagen mit chemischen oder physikalischen Methoden⁸ in der Regel zu Makrophagenaktivierung und Abbau der transfizierten Nukleinsäuren oder sogar zum Makrophagenselbstmord mittels Pyroptose, einer Form des programmierten lytischen Zelltodes, der nach Erkennung von zytosolischen PAMPs/DAMPs wie DNA oder Fremd-RNA⁹ausgelöst wird. Biologische Transfektion von Makrophagen mit Viren wie Adenoviren oder Lentiviren als Vektoren ist oft effizienter, aber die Konstruktion solcher viralen Vektoren ist zeitaufwändig und erfordert Biosicherheitsausrüstung der Stufe 2^10,11.

Obwohl Makrophagen intensiv erforscht werden, wird die Analyse ihrer Funktionen auf molekularer Ebene dadurch erschwert, dass eines der wichtigsten Instrumente der Molekularbiologie, die Transfektion von Nukleinsäurekonstrukten zur exogenen Expression von Proteine, ist kaum anwendbar. Dies zwingt Forscher oft dazu, makrophagenähnliche Zelllinien anstelle von bona fide Makrophagen zu verwenden. Anwendungen für Nukleinsäurekonstrukttransfektion enzinieren die Expression mutierter oder getaggter Proteinversionen, die Überexpression eines bestimmten Proteins, die Proteinreexpression in einem entsprechenden Knockout-Hintergrund und die Expression von Proteinen anderer Arten (z. B. , Cre Recombinase oder Guide RNA und Cas9 für gezielte Gen Knockout).

Hier beschreiben wir ein Protokoll, das hocheffiziente Transfektion von (in der Regel schwer zu transfekten) primären Makrophagen ermöglicht, d. h. murinen peritonealen Makrophagen (PM) und Knochenmark-abgeleiteten Makrophagen (BMDM) mit mRNA, die aus DNA-Vorlagen wie Plasmiden generiert werden. Wichtig ist, dass die mit diesem Protokoll erzeugte in vitro transkribierte mRNA die natürlich vorkommenden modifizierten Nukleoside nukleoside nucleosides 5-methyl-CTP und Pseudo-UTP enthält, die die Immunogenität reduzieren und die^Stabilität4^,6,7,12,13. Darüber hinaus werden die 5′-Enden der in vitro transkribierten mRNA durch antarktische Phosphatase dephosphoryliert, um die Erkennung durch den RIG-I-Komplex^14,15zu verhindern. Dies minimiert die angeborene Immunerkennung der in vitro transkribierten mRNA. Mit unserem einfach durchzuführenden Protokoll werden Transfektionsraten zwischen 50-65% (Peritonealmakropages (PM)) und 85% (BMDM) erreicht, während, was wichtig ist, keine Zytotoxizität oder Immunogenität beobachtet wird. Wir beschreiben detailliert (i) wie die immunologisch stumme mRNA zur Transfektion aus DNA-Konstrukten wie Plasmiden und (ii) dem Transfektionsverfahren selbst erzeugt werden kann.

Protocol

Die Makrophagenisolierung von Mäusen erfolgte nach dem Tierschutzgesetz Deutschlands in Übereinstimmung mit der Ethikkommission der Universität Köln. HINWEIS: Führen Sie alle Schritte mit Handschuhen. Führen Sie alle Transfektionsschritte unter einer laminaren Durchflusshaube durch, um eine Kontamination der Zellen zu verhindern. Reinigen Sie vor der Arbeit mit mRNA alle Instrumente wie Pipetten und jede Oberfläche mit 70 % Ethanol und/oder einem RNAse-abbauenden Tensid…

Representative Results

Wir haben dieses Protokoll erfolgreich verwendet, um mRNA-Codierung für FLAG-markierte NEMO- und IKK-Varianten für die Transfektion von primären Makrophagen16zu generieren. Die Plasmide, die für FLAG-markierte Wildtyp (NEMOWT) und C54/347A mutierte NEMO (NEMOC54/374A) (siehe Materialtabelle) kodieren, enthalten bereits einen T7-Promotor in der richtigen Ausrichtung (Abbildung 1A</stron…

Discussion

Hier stellen wir ein Protokoll zur hocheffizienten Transfektion von meist schwer transfekten primären Makrophagen mit in vitro transkribierter mRNA vor. Wichtig ist, dass die Transfektion der Makrophagen mit diesem Protokoll weder den Zelltod induziert noch die proinflammatorische Signalisierung aktiviert, was darauf hinweist, dass weder das Transfektionsreagenz noch die transfizierte mRNA als nicht-selbst erkannt werden.

Die Qualität der mRNA ist von zentraler Bedeutung für die erfolgreich…

Materials

5-methyl-CTP (100 mM)	Jena Biosience	NU-1138S	stored at -20 °C
Antarctic phosphatase	New England BioLabs	M0289	stored at -20 °C
Antarctic phosphatase reaction buffer (10X)	New England BioLabs	B0289	stored at -20 °C
anti-NEMO/IKKγ antibody	Invitrogen	MA1-41046	stored at -20 °C
anti-β-actin antibody	Sigma-Aldrich	A2228	stored at -20 °C
Petri dishes 92,16 mm with cams	Sarstedt	821,473	stored at RT
CD11b Microbeads mouse and human	Miltenyi Biotec	130-049-601	stored at 4 °C
Cre recombinase + T7-Promotor forward primer	Sigma-Aldrich		5′-GAAATTAATACGACTCACTATA GGGGCAGCCGCCACCATGTCC AATTTACTGACCGTAC-3´, stored at -20 °C
Cre recombinase + T7-Promotor reverse primer	Sigma-Aldrich		5′-CTAATCGCCATCTTCCAGCAGG C-3′, stored at -20 °C
DNA purification kit: QIAquick PCR purification Kit	Qiagen	28104	stored at RT
eGFP + T7-Promotor forward primer	Sigma-Aldrich		5´-GAAATTAATACGACTCACTATA GGGATCCATCGCCACCATGGTG AGCAAGG-3´, stored at -20 °C
eGFP + T7-Promotor reverse primer	Sigma-Aldrich		5´-TGGTATGGCTGATTA TGATCTAGAGTCG-3´, stored at -20 °C
Fast Digest buffer (10X)	Thermo Scientific	B64	stored at -20 °C
FastDigest XbaI	Thermo Scientific	FD0684	stored at -20 °C
high-fidelity polymerase with proofreading: Q5 High-Fidelity DNA-Polymerase	New England Biolabs Inc	M0491S	stored at -20 °C
IKKβ + T7-Promotor forward primer	Sigma-Aldrich		5′-GAAATTAATACGACTCACTATA GGGTTGATCTACCATGGACTACA AAGACG-3′, stored at -20 °C
IKKβ + T7-Promotor reverse primer	Sigma-Aldrich		5′-GAGGAAGCGAGAGCT-CCATCTG-3′, stored at -20 °C
in vitro mRNA transcription kit: HiScribe T7 ARCA mRNA kit (with polyA tailing)	New England BioLabs	E2060	stored at -20 °C
LS Columns	Miltenyi Biotec	130-042-401	stored at RT
MACS MultiStand	Miltenyi Biotec	130-042-303	stored at RT
mRNA transfection buffer and reagent: jetMESSENGER	Polyplus transfection	409-0001DE	stored at 4 °C
Mutant IKKβ IKK-2S177/181E plasmid	Addgene	11105	stored at -20 °C
Mutant NEMOC54/347A plasmid	Addgene	27268	stored at -20 °C
pEGFP-N3 plasmid	Addgene	62043	stored at -20 °C
poly(I:C)	Calbiochem	528906	stored at -20 °C
pPGK-Cre plasmid			F. T. Wunderlich, H. Wildner, K. Rajewsky, F. Edenhofer, New variants of inducible Cre recombinase: A novel mutant of Cre-PR fusion protein exhibits enhanced sensitivity and an expanded range of inducibility. Nucleic Acids Res. 29, 47e (2001). stored at -20 °C
pseudo-UTP (100 mM)	Jena Biosience	NU-1139S	stored at -20 °C
QuadroMACS Separator	Miltenyi Biotec	130-090-976	stored at RT
Rat-anti-mouse CD11b antibody, APC-conjugated	BioLegend	101212	stored at 4 °C
Rat-anti-mouse F4/80 antibody, PE-conjugated	eBioscience	12-4801-82	stored at 4 °C
recombinant M-CSF	Peprotech	315-02	stored at -20 °C
RNA purification kit: MEGAclear transcription clean-up kit	ThermoFisher Scientific	AM1908	stored at 4 °C
RNAse-degrading surfactant: RnaseZAP	Sigma-Aldrich	R2020	stored at RT
ultrapure LPS from E.coli O111:B4	Invivogen		stored at -20 °C
Wild type IKKβ plasmid	Addgene	11103	stored at -20 °C
Wild type NEMO plasmid	Addgene	27268	stored at -20 °C