Trasfezione altamente efficiente dei macrofagi primari con mRNA trascritto in vitro

Summary

I macrofagi, in particolare i macrofagi primari, sono difficili da trasfecare in quanto sono specializzati nel rilevamento di molecole di origine non auto. Descriviamo un protocollo che consente una trasfezione altamente efficiente dei macrofagi primari con mRNA generati da modelli di DNA come i plasmidi.

Abstract

I macrofagi sono cellule fagocitiche specializzate nel rilevamento di molecole di origine non auto. A tal fine, sono dotati di una vasta gamma di recettori di riconoscimento dei pattern (PRR). Purtroppo, questo rende anche i macrofagi particolarmente difficili da trasfecare poiché il reagente di trasfezione e gli acidi nucleici trafetti sono spesso riconosciuti dai PRR come non-sé. Pertanto, la trasfezione spesso si traduce nell’attivazione del macrofago e nella degradazione degli acidi nucleici trafetti o anche nel suicidio dei macrofagi. Qui, descriviamo un protocollo che consente la trasfezione altamente efficiente di macrofagi primari murini come macrofagi peritoneali (PM) e macrofagi derivati dal midollo osseo (BMDM) con mRNA in vitro trascritto da modelli di DNA come plasmidi. Con questo semplice protocollo, i tassi di trasfezione di circa il 50-65% per il PM e circa l’85% per il BMDM sono raggiunti senza citotossicità o immunogenicità osservata. Descriviamo in dettaglio la generazione di mRNA per la trasfezione da costrutti di DNA come plasmidi e la procedura di trasfezione.

Introduction

I macrofagi sono cellule fagocitiche specializzate nel rilevamento, l’ingestione e la degradazione di microbi, cellule apoptotiche e detriti cellulari. Inoltre, aiutano a orchestrare le risposte immunitarie secernendo citochine e chemiochine e presentando antigeni alle cellule T e alle cellule B. I macrofagi svolgono anche un ruolo importante in numerosi altri processi, come la guarigione delle ferite, l’aterosclerosi, la tumorigenesi e l’obesità.

Per essere in grado di rilevare molecole non autonome come i modelli molecolari associati ai patogeni (PEN) e le molecole fuori luogo come i modelli molecolari associati ai danni (DAMP), i macrofagi sono dotati di una vasta gamma di recettori di riconoscimento dei modelli (PRR)¹. Purtroppo, questo rende anche i macrofagi particolarmente difficili da trasfect² come la reagente di trasfezione³ e gli acidi nucleici transfettici^4,5,6,7 spesso sono riconosciuti dai PRR come non-sé. Per questo motivo, la trasfezione dei macrofagi utilizzando metodi chimici o fisici⁸ di solito si traduce nell’attivazione del macrofago e nella degradazione degli acidi nucleici transfettati o anche nel suicidio del macrofago tramite piroptosi, una forma di morte programmata delle cellule littiche innescata dopo il riconoscimento di PIS citosolici/DAMP come IL DNA o l’RNA estraneo⁹. La trasfezione biologica dei macrofagi utilizzando virus come adenovirus o lentivirus poiché i vettori sono spesso più efficienti, ma la costruzione di tali vettori virali richiede molto tempo e richiede il livello di biosicurezza 2 attrezzature^10,11.

Così, anche se i macrofagi sono oggetto di un’intensa ricerca, l’analisi delle loro funzioni a livello molecolare è ostacolata perché uno degli strumenti più importanti della biologia molecolare, la trasfezione di costrutti di acido nucleico per l’espressione esogena di proteine, è difficilmente applicabile. Questo spesso costringe i ricercatori a usare linee cellulari simili a macrofagi piuttosto che macrofagi in buona fede. Le applicazioni per la trasfezione di costruzione dell’acido nucleico includono l’espressione di versioni proteiche mutate o marcate, la sovraespressione di una proteina specifica, la rielezione delle proteine in un rispettivo sottofondo knockout e l’espressione di proteine di altre specie (ad esempio, , Cre ricombinante o guida RNA e Cas9 per l’eliminazione mirata del gene).

Qui, descriviamo un protocollo che permette la trasfezione altamente efficiente di macrofagi primari (solitamente difficili da trasfecti), che sono macrofagi peritoneici murini (PM) e macrofagi derivati dal midollo osseo (BMDM) con mRNA generato da modelli di DNA come plasmidi. È importante sottolineare che l’mRNA trascritto in vitro generato utilizzando questo protocollo contiene i nucleoside modificati naturali 5-metili-CTP e pseudo-UTP che riducono l’immunogenicità e migliorano la stabilità^4,6,7,12,13. Inoltre, le 5’estremità dell’mRNA trascritto in vitro sono dephofosrylated da fosforesi antartiche per impedire il riconoscimento da parte del complesso RIG-I^14,15. Questo riduce al minimo il riconoscimento immunitario innato dell’mRNA trascritto in vitro. Con il nostro protocollo facile da eseguire, i tassi di trasfezione tra 50-65% (macrofagi peritoneali (PM)) e 85% (BMDM) sono raggiunti mentre, soprattutto, non vi è alcuna citotossicità o immunogenicità osservata. Descriviamo in dettaglio (i) come l’mRNA immunologicamente silenziato per la trasfezione può essere generato da costrutti di DNA come plasmidi e (ii) la procedura di trasfezione stessa.

Protocol

L’isolamento dei macrofafi dai topi è stato eseguito in conformità con la legge tedesca sulla protezione degli animali, in conformità con il Comitato Etico dell’Università di Colonia. NOT:</ Eseguire tutti i gradini indossando guanti. Eseguire tutte le fasi di trasfezione sotto un cappuccio a flusso laminare per prevenire la contaminazione delle cellule. Prima di lavorare con l’mRNA, pulire tutti gli strumenti come pipette e ogni superficie con 70% etanolo e/o un surfactant c…

Representative Results

Abbiamo utilizzato con successo questo protocollo per generare la codifica mRNA per le varianti NEMO e IKK per la trasfezione dei macrofagi primari16. La codifica plasmids per il tipo selvaggio con tag FLAG (NEMOWT) e il tipo di mutante C54/347A NEMO (NEMOC54/374A) (si veda la Tabella dei Materiali) contengono già un promotore T7 nell’orientamento corretto ( Figura1A). Così, abb…

Discussion

Qui presentiamo un protocollo per la trasfezione altamente efficiente di macrofagi primari solitamente difficili da raggiungere con mRNA tranincato in vitro. È importante sottolineare che la trasfezione dei macrofagi utilizzando questo protocollo non induce la morte cellulare né attiva la segnalazione infiammatoria che indica che né il reagente di trafezione né l’mRNA trascurato sono riconosciuti come non-sé.

La qualità dell’mRNA è di fondamentale importanza per la trasfezione di succes…

Materials

5-methyl-CTP (100 mM)	Jena Biosience	NU-1138S	stored at -20 °C
Antarctic phosphatase	New England BioLabs	M0289	stored at -20 °C
Antarctic phosphatase reaction buffer (10X)	New England BioLabs	B0289	stored at -20 °C
anti-NEMO/IKKγ antibody	Invitrogen	MA1-41046	stored at -20 °C
anti-β-actin antibody	Sigma-Aldrich	A2228	stored at -20 °C
Petri dishes 92,16 mm with cams	Sarstedt	821,473	stored at RT
CD11b Microbeads mouse and human	Miltenyi Biotec	130-049-601	stored at 4 °C
Cre recombinase + T7-Promotor forward primer	Sigma-Aldrich		5′-GAAATTAATACGACTCACTATA GGGGCAGCCGCCACCATGTCC AATTTACTGACCGTAC-3´, stored at -20 °C
Cre recombinase + T7-Promotor reverse primer	Sigma-Aldrich		5′-CTAATCGCCATCTTCCAGCAGG C-3′, stored at -20 °C
DNA purification kit: QIAquick PCR purification Kit	Qiagen	28104	stored at RT
eGFP + T7-Promotor forward primer	Sigma-Aldrich		5´-GAAATTAATACGACTCACTATA GGGATCCATCGCCACCATGGTG AGCAAGG-3´, stored at -20 °C
eGFP + T7-Promotor reverse primer	Sigma-Aldrich		5´-TGGTATGGCTGATTA TGATCTAGAGTCG-3´, stored at -20 °C
Fast Digest buffer (10X)	Thermo Scientific	B64	stored at -20 °C
FastDigest XbaI	Thermo Scientific	FD0684	stored at -20 °C
high-fidelity polymerase with proofreading: Q5 High-Fidelity DNA-Polymerase	New England Biolabs Inc	M0491S	stored at -20 °C
IKKβ + T7-Promotor forward primer	Sigma-Aldrich		5′-GAAATTAATACGACTCACTATA GGGTTGATCTACCATGGACTACA AAGACG-3′, stored at -20 °C
IKKβ + T7-Promotor reverse primer	Sigma-Aldrich		5′-GAGGAAGCGAGAGCT-CCATCTG-3′, stored at -20 °C
in vitro mRNA transcription kit: HiScribe T7 ARCA mRNA kit (with polyA tailing)	New England BioLabs	E2060	stored at -20 °C
LS Columns	Miltenyi Biotec	130-042-401	stored at RT
MACS MultiStand	Miltenyi Biotec	130-042-303	stored at RT
mRNA transfection buffer and reagent: jetMESSENGER	Polyplus transfection	409-0001DE	stored at 4 °C
Mutant IKKβ IKK-2S177/181E plasmid	Addgene	11105	stored at -20 °C
Mutant NEMOC54/347A plasmid	Addgene	27268	stored at -20 °C
pEGFP-N3 plasmid	Addgene	62043	stored at -20 °C
poly(I:C)	Calbiochem	528906	stored at -20 °C
pPGK-Cre plasmid			F. T. Wunderlich, H. Wildner, K. Rajewsky, F. Edenhofer, New variants of inducible Cre recombinase: A novel mutant of Cre-PR fusion protein exhibits enhanced sensitivity and an expanded range of inducibility. Nucleic Acids Res. 29, 47e (2001). stored at -20 °C
pseudo-UTP (100 mM)	Jena Biosience	NU-1139S	stored at -20 °C
QuadroMACS Separator	Miltenyi Biotec	130-090-976	stored at RT
Rat-anti-mouse CD11b antibody, APC-conjugated	BioLegend	101212	stored at 4 °C
Rat-anti-mouse F4/80 antibody, PE-conjugated	eBioscience	12-4801-82	stored at 4 °C
recombinant M-CSF	Peprotech	315-02	stored at -20 °C
RNA purification kit: MEGAclear transcription clean-up kit	ThermoFisher Scientific	AM1908	stored at 4 °C
RNAse-degrading surfactant: RnaseZAP	Sigma-Aldrich	R2020	stored at RT
ultrapure LPS from E.coli O111:B4	Invivogen		stored at -20 °C
Wild type IKKβ plasmid	Addgene	11103	stored at -20 °C
Wild type NEMO plasmid	Addgene	27268	stored at -20 °C