Transfecção altamente eficiente de macrófagos primários com mRNA Transcrito in vitro

Summary

Macrófagos, especialmente macrófagos primários, são um desafio para transfect como eles se especializam na detecção de moléculas de não-origem auto. Descrevemos um protocolo que permite a transfecção altamente eficiente de macrófagos primários com mRNA gerado a partir de modelos de DNA, como plasmídeos.

Abstract

Macrófagos são células fagocíticas especializadas na detecção de moléculas de origem não-auto. Para este fim, eles estão equipados com uma grande variedade de receptores de reconhecimento de padrões (PRRs). Infelizmente, isso também torna os macrófagos particularmente desafiadores para transfect como o reagente de transfecção e os ácidos nucleicos transinfectados são muitas vezes reconhecidos pelas PRRs como não-auto. Portanto, a transfecção muitas vezes resulta em ativação de macrófagos e degradação dos ácidos nucleicos transinfectados ou mesmo no suicídio dos macrófagos. Aqui, descrevemos um protocolo que permite a transfecção altamente eficiente de macrófagos primários de urina, como macrófagos peritoneal (PM) e macrófagos derivados de medula óssea (BMDM) com mRNA in vitro transcrito de modelos de DNA, como plasmídeos. Com esse protocolo simples, as taxas de transfecção de cerca de 50-65% para PM e cerca de 85% para BMDM são alcançadas sem citotoxicidade ou imunogenicidade observada. Descrevemos em detalhes a geração de mRNA para transfecção a partir de construções de DNA, como plasmídeos e o procedimento de transfecção.

Introduction

Macrófagos são células fagocíticas especializadas na detecção, ingestão e degradação de micróbios, células apoptóticas e detritos celulares. Além disso, eles ajudam a orquestrar as respostas imunes, secretando citocinas e quimiocinas e apresentando antígenos às células T e células B. Macrófagos também desempenham papéis importantes em inúmeros outros processos, como cicatrização de feridas, aterosclerose, tumorigênese e obesidade.

Para ser capaz de detectar moléculas não-auto, como padrões moleculares associados a patógenos (PAMPs) e moléculas fora do local, como padrões moleculares associados a danos (DAMPs), macrófagos são equipados com uma grande variedade de receptores de reconhecimento de padrões (PRR)¹. Infelizmente, isso também torna os macrófagos particularmente desafiadores para transfect² como o reagente de transfecção³ e os ácidos nucleicos transinfectados^4,5,6,7 muitas vezes são reconhecidos pelas PRRs como não-auto. Por esta razão, a transfecção de macrófagos usando métodos químicos ou físicos⁸ geralmente resulta em ativação de macrófagos e degradação dos ácidos nucleicos transinfectados ou mesmo no suicídio de macrófagos via piroptose, uma forma de morte programada de células líticas desencadeada após o reconhecimento de PAMPs citosólicos/ DAMPs como DNA ou^RNA9 estrangeiros . Transfecção biológica de macrófagos usando vírus como adenovírus ou lentivírus como vetores é muitas vezes mais eficiente, mas a construção de tais vetores virais é demorado e requer biossegurança nível 2 equipamento^10,11.

Assim, embora os macrófagos sejam objeto de intensa pesquisa, a análise de suas funções no nível molecular é dificultada porque uma das ferramentas mais importantes da biologia molecular, a transfecção de construções de ácido nucleico para expressão exógena de proteínas, não é aplicável. Isso muitas vezes força os pesquisadores a usar linhas celulares semelhantes a macrófagos semelhantes a macrófagos de macrófagos de boa-fé. As aplicações para a transfecção de construção de ácido nucleico incluem expressão de versões proteicas mutadas ou marcadas, superexpressão de uma proteína específica, reexpressão proteica em um respectivo contexto nocaute e expressão de proteínas de outras espécies (por exemplo. , Cre recombinando ou guia RNA e Cas9 para nocaute genético alvo).

Aqui, descrevemos um protocolo que permite a transfecção altamente eficiente de macrófagos primários (geralmente difíceis de transfect), que são macrófagos peritoneal murine (PM) e macrófagos derivados de medula óssea (BMDM) com mRNA geradoa a partir de modelos de DNA, como plasmídeos. Importante, o mRNA transcrito in vitro gerado usando este protocolo contém os nucleosídeos modificados naturais 5-metil-CTPe pseudo-UTP que reduzem a imunogenicidade e aumentam a estabilidade^{4,6,7,12, 12}. Além disso, as extremidades de 5 do mRNA transcrita in vitro são desfosforilado pela fosfatase antártica para evitar o reconhecimento pelo complexo RIG-I^14,15. Isso minimiza o reconhecimento imunológico inato do mRNA transcrito in vitro. Com nosso protocolo fácil de executar, as taxas de transfecção entre 50-65% (macrófagos peritoneal (PM)) e 85% (BMDM) são alcançadas enquanto, importante, não há citotoxicidade ou imunogenicidade observada. Descrevemos em detalhes (i) como o mRNA imunologicamente silenciado para transfecção pode ser gerado a partir de construções de DNA, como plasmídeos e (ii) o próprio procedimento de transfecção.

Protocol

O isolamento de macrófagos de camundongos foi realizado de acordo com a Lei de Proteção animal da Alemanha, em conformidade com o Comitê de Ética da Universidade de Colônia. Nota: Realizar todas as etapas usando luvas. Realize todas as etapas de transfecção um capô de fluxo laminar para evitar a contaminação das células. Antes de trabalhar com mRNA, limpe todos os instrumentos, como pipetas e cada superfície com 70% de etanol e/ou um surfactante rnase-degradante<s…

Representative Results

Usamos com sucesso este protocolo para gerar codificação de mRNA para variantes NEMO e IKKβ marcadas pela BANDEIRA para transfecção de macrófagos primários16. Os plasmídeos codificando para o tipo selvagem marcado pela BANDEIRA (NEMOWT)e o mutante C54/347A NEMO (NEMOC54/374A)(ver a Tabela de Materiais)já contêm um promotor T7 na orientação correta (Figura 1A). Assim, s…

Discussion

Aqui apresentamos um protocolo para transfecção altamente eficiente de macrófagos primários geralmente difíceis de transfect com mRNA transcrita in vitro. É importante ressaltar que a transfecção dos macrófagos que utilizam este protocolo não induz a morte celular nem ativa a sinalização proinflamatória indicando que nem o reagente da transfecção nem o mRNA transinfectado são reconhecidos como não-eu.

A qualidade do mRNA é de importância fundamental para a transfecção bem-…

Materials

5-methyl-CTP (100 mM)	Jena Biosience	NU-1138S	stored at -20 °C
Antarctic phosphatase	New England BioLabs	M0289	stored at -20 °C
Antarctic phosphatase reaction buffer (10X)	New England BioLabs	B0289	stored at -20 °C
anti-NEMO/IKKγ antibody	Invitrogen	MA1-41046	stored at -20 °C
anti-β-actin antibody	Sigma-Aldrich	A2228	stored at -20 °C
Petri dishes 92,16 mm with cams	Sarstedt	821,473	stored at RT
CD11b Microbeads mouse and human	Miltenyi Biotec	130-049-601	stored at 4 °C
Cre recombinase + T7-Promotor forward primer	Sigma-Aldrich		5′-GAAATTAATACGACTCACTATA GGGGCAGCCGCCACCATGTCC AATTTACTGACCGTAC-3´, stored at -20 °C
Cre recombinase + T7-Promotor reverse primer	Sigma-Aldrich		5′-CTAATCGCCATCTTCCAGCAGG C-3′, stored at -20 °C
DNA purification kit: QIAquick PCR purification Kit	Qiagen	28104	stored at RT
eGFP + T7-Promotor forward primer	Sigma-Aldrich		5´-GAAATTAATACGACTCACTATA GGGATCCATCGCCACCATGGTG AGCAAGG-3´, stored at -20 °C
eGFP + T7-Promotor reverse primer	Sigma-Aldrich		5´-TGGTATGGCTGATTA TGATCTAGAGTCG-3´, stored at -20 °C
Fast Digest buffer (10X)	Thermo Scientific	B64	stored at -20 °C
FastDigest XbaI	Thermo Scientific	FD0684	stored at -20 °C
high-fidelity polymerase with proofreading: Q5 High-Fidelity DNA-Polymerase	New England Biolabs Inc	M0491S	stored at -20 °C
IKKβ + T7-Promotor forward primer	Sigma-Aldrich		5′-GAAATTAATACGACTCACTATA GGGTTGATCTACCATGGACTACA AAGACG-3′, stored at -20 °C
IKKβ + T7-Promotor reverse primer	Sigma-Aldrich		5′-GAGGAAGCGAGAGCT-CCATCTG-3′, stored at -20 °C
in vitro mRNA transcription kit: HiScribe T7 ARCA mRNA kit (with polyA tailing)	New England BioLabs	E2060	stored at -20 °C
LS Columns	Miltenyi Biotec	130-042-401	stored at RT
MACS MultiStand	Miltenyi Biotec	130-042-303	stored at RT
mRNA transfection buffer and reagent: jetMESSENGER	Polyplus transfection	409-0001DE	stored at 4 °C
Mutant IKKβ IKK-2S177/181E plasmid	Addgene	11105	stored at -20 °C
Mutant NEMOC54/347A plasmid	Addgene	27268	stored at -20 °C
pEGFP-N3 plasmid	Addgene	62043	stored at -20 °C
poly(I:C)	Calbiochem	528906	stored at -20 °C
pPGK-Cre plasmid			F. T. Wunderlich, H. Wildner, K. Rajewsky, F. Edenhofer, New variants of inducible Cre recombinase: A novel mutant of Cre-PR fusion protein exhibits enhanced sensitivity and an expanded range of inducibility. Nucleic Acids Res. 29, 47e (2001). stored at -20 °C
pseudo-UTP (100 mM)	Jena Biosience	NU-1139S	stored at -20 °C
QuadroMACS Separator	Miltenyi Biotec	130-090-976	stored at RT
Rat-anti-mouse CD11b antibody, APC-conjugated	BioLegend	101212	stored at 4 °C
Rat-anti-mouse F4/80 antibody, PE-conjugated	eBioscience	12-4801-82	stored at 4 °C
recombinant M-CSF	Peprotech	315-02	stored at -20 °C
RNA purification kit: MEGAclear transcription clean-up kit	ThermoFisher Scientific	AM1908	stored at 4 °C
RNAse-degrading surfactant: RnaseZAP	Sigma-Aldrich	R2020	stored at RT
ultrapure LPS from E.coli O111:B4	Invivogen		stored at -20 °C
Wild type IKKβ plasmid	Addgene	11103	stored at -20 °C
Wild type NEMO plasmid	Addgene	27268	stored at -20 °C