Transfección altamente eficiente de macrófagos primarios con ARNm transcrito in Vitro

Summary

Los macrófagos, especialmente los macrófagos primarios, son difíciles de transfectar, ya que se especializan en la detección de moléculas de origen no propio. Describimos un protocolo que permite la transfección altamente eficiente de macrófagos primarios con ARNm generados a partir de plantillas de ADN como plásmidos.

Abstract

Los macrófagos son células fagocíticas especializadas en la detección de moléculas de origen no propio. Con este fin, están equipados con una gran variedad de receptores de reconocimiento de patrones (PRR). Desafortunadamente, esto también hace que los macrófagos sean particularmente difíciles de transfectar, ya que el reactivo de transfección y los ácidos nucleicos transinfectados a menudo son reconocidos por los PRR como no-yo. Por lo tanto, la transfección a menudo resulta en la activación de macrófagos y la degradación de los ácidos nucleicos transinfectados o incluso en el suicidio de los macrófagos. Aquí, describimos un protocolo que permite la transfección altamente eficiente de macrófagos primarios murinos como macrófagos peritoneales (PM) y macrófagos derivados de la médula ósea (BMDM) con ARNm en vitro transcrito a partir de plantillas de ADN como plásmidos. Con este sencillo protocolo, se alcanzan tasas de transfección de aproximadamente 50-65% para PM y de aproximadamente 85% para BMDM sin citotoxicidad ni inmunogenicidad observada. Describimos en detalle la generación de ARNm para la transfección a partir de construcciones de ADN como plásmidos y el procedimiento de transfección.

Introduction

Los macrófagos son células fagocíticas que se especializan en la detección, ingesta y degradación de microbios, células apoptóticas y desechos celulares. Además, ayudan a orquestar las respuestas inmunitarias secretando citoquinas y quimioquinas y presentando antígenos a las células T y células B. Los macrófagos también desempeñan un papel importante en numerosos otros procesos, como la cicatrización de heridas, la aterosclerosis, la tumorigenesis y la obesidad.

Para poder detectar moléculas no propias, como los patrones moleculares asociados a patógenos (PamP) y las moléculas fuera de lugar, como los patrones moleculares asociados al daño (DAPP), los macrófagos están equipados con una amplia gama de receptores de reconocimiento de patrones (PRR)¹. Desafortunadamente, esto también hace que los macrófagos sean particularmente difíciles de transfectar² como el reactivo de transfección³ y los ácidos nucleicos transinfectados^4,5,6,7 a menudo son reconocidos por los PRR como no-yo. Por esta razón, la transfección de macrófagos utilizando métodos químicos o físicos⁸ suele dar lugar a la activación de macrófagos y la degradación de los ácidos nucleicos transcijos o incluso en el suicidio de macrófagos a través de la piroptosis, una forma de muerte celular lítica programada desencadenada después del reconocimiento de Los PamP/DMIP citosólicos, como el ADN o el ARN extraño^9. La transfección biológica de macrófagos utilizando virus como adenovirus o lentivirus como vectores es a menudo más eficiente, sin embargo, la construcción de estos vectores virales es lenta y requiere equipos de nivel 2 de bioseguridad^10,11.

Así, aunque los macrófagos son objeto de una intensa investigación, el análisis de sus funciones a nivel molecular se ve obstaculizado porque una de las herramientas más importantes de la biología molecular, la transfección de construcciones de ácido nucleico para la expresión exógena de proteínas, no es aplicable. Esto a menudo obliga a los investigadores a utilizar líneas celulares similares a macrófagos en lugar de macrófagos de buena fe. Las aplicaciones para la transfección de construcción de ácido nucleico incluyen la expresión de versiones de proteínas mutadas o etiquetadas, la sobreexpresión de una proteína específica, la reexpresión de proteínas en un fondo de eliminatoria respectivo y la expresión de proteínas de otras especies (por ejemplo. , Cre recombinase o ARN guía y Cas9 para el knockout genético dirigido).

Aquí, describimos un protocolo que permite la transfección altamente eficiente de macrófagos primarios (generalmente difíciles de transfectar), es decir, macrófagos peritoneales murinos (PM) y macrófagos derivados de médula ósea (BMDM) con ARNm generado a partir de plantillas de ADN como plásmidos. Es importante destacar que el ARNm transcrito in vitro generado con este protocolo contiene los nucleósidos modificados de origen natural 5-metil-CTP y pseudo-UTP que reducen la inmunogenicidad y mejoran la estabilidad^4,6,7,^12,13. Además, los 5′-extremos del ARNm transcrito in vitro son desfosforilados por la fosfatasa antártica para evitar el reconocimiento por el complejo RIG-I^14,15. Esto minimiza el reconocimiento inmune innato del ARNm transcrito in vitro. Con nuestro protocolo fácil de realizar, se alcanzan tasas de transfección entre 50-65% (macrófagos peritoneales (PM)) y 85% (BMDM) mientras que, lo que es importante, no se observacitotoxicidad ni inmunogenicidad. Describimos en detalle (i) cómo el ARNm silenciado inmunológicamente para la transfección se puede generar a partir de construcciones de ADN como plásmidos y (ii) el propio procedimiento de transfección.

Protocol

El aislamiento de macrófagos de ratones se realizó de conformidad con la Ley de Protección Animal de Alemania en cumplimiento con el Comité de ética de la Universidad de Colonia. NOTA: Lleve a cabo todos los pasos con guantes. Llevar a cabo todos los pasos de transfección bajo una campana de flujo laminar para evitar la contaminación de las células. Antes de trabajar con ARNm, limpie todos los instrumentos, como pipetas y todas las superficies con un 70% de etanol y/o …

Representative Results

Hemos utilizado con éxito este protocolo para generar codificación mRNA para las variantes ETIQUETADAs por FLAG NEMO e IKK para la transfección de macrófagos primarios16. La codificación de plásmidos para el tipo salvaje con etiqueta FLAG (NEMOWT) y C54/347A mutante NEMO (NEMOC54/374A) (véase la Tabla de Materiales) ya contienen un promotor T7 en la orientación correcta(Figura 1A</…

Discussion

Aquí presentamos un protocolo para la transfección altamente eficiente de macrófagos primarios generalmente difíciles de transfectar con ARNm transcrito in vitro. Es importante destacar que la transfección de los macrófagos utilizando este protocolo no induce la muerte celular ni activa la señalización proinflamatoria, lo que indica que ni el reactivo de transfección ni el ARNm transfectóse se reconocen como no autónomos.

La calidad del ARNm es de vital importancia para el éxito de…

Materials

5-methyl-CTP (100 mM)	Jena Biosience	NU-1138S	stored at -20 °C
Antarctic phosphatase	New England BioLabs	M0289	stored at -20 °C
Antarctic phosphatase reaction buffer (10X)	New England BioLabs	B0289	stored at -20 °C
anti-NEMO/IKKγ antibody	Invitrogen	MA1-41046	stored at -20 °C
anti-β-actin antibody	Sigma-Aldrich	A2228	stored at -20 °C
Petri dishes 92,16 mm with cams	Sarstedt	821,473	stored at RT
CD11b Microbeads mouse and human	Miltenyi Biotec	130-049-601	stored at 4 °C
Cre recombinase + T7-Promotor forward primer	Sigma-Aldrich		5′-GAAATTAATACGACTCACTATA GGGGCAGCCGCCACCATGTCC AATTTACTGACCGTAC-3´, stored at -20 °C
Cre recombinase + T7-Promotor reverse primer	Sigma-Aldrich		5′-CTAATCGCCATCTTCCAGCAGG C-3′, stored at -20 °C
DNA purification kit: QIAquick PCR purification Kit	Qiagen	28104	stored at RT
eGFP + T7-Promotor forward primer	Sigma-Aldrich		5´-GAAATTAATACGACTCACTATA GGGATCCATCGCCACCATGGTG AGCAAGG-3´, stored at -20 °C
eGFP + T7-Promotor reverse primer	Sigma-Aldrich		5´-TGGTATGGCTGATTA TGATCTAGAGTCG-3´, stored at -20 °C
Fast Digest buffer (10X)	Thermo Scientific	B64	stored at -20 °C
FastDigest XbaI	Thermo Scientific	FD0684	stored at -20 °C
high-fidelity polymerase with proofreading: Q5 High-Fidelity DNA-Polymerase	New England Biolabs Inc	M0491S	stored at -20 °C
IKKβ + T7-Promotor forward primer	Sigma-Aldrich		5′-GAAATTAATACGACTCACTATA GGGTTGATCTACCATGGACTACA AAGACG-3′, stored at -20 °C
IKKβ + T7-Promotor reverse primer	Sigma-Aldrich		5′-GAGGAAGCGAGAGCT-CCATCTG-3′, stored at -20 °C
in vitro mRNA transcription kit: HiScribe T7 ARCA mRNA kit (with polyA tailing)	New England BioLabs	E2060	stored at -20 °C
LS Columns	Miltenyi Biotec	130-042-401	stored at RT
MACS MultiStand	Miltenyi Biotec	130-042-303	stored at RT
mRNA transfection buffer and reagent: jetMESSENGER	Polyplus transfection	409-0001DE	stored at 4 °C
Mutant IKKβ IKK-2S177/181E plasmid	Addgene	11105	stored at -20 °C
Mutant NEMOC54/347A plasmid	Addgene	27268	stored at -20 °C
pEGFP-N3 plasmid	Addgene	62043	stored at -20 °C
poly(I:C)	Calbiochem	528906	stored at -20 °C
pPGK-Cre plasmid			F. T. Wunderlich, H. Wildner, K. Rajewsky, F. Edenhofer, New variants of inducible Cre recombinase: A novel mutant of Cre-PR fusion protein exhibits enhanced sensitivity and an expanded range of inducibility. Nucleic Acids Res. 29, 47e (2001). stored at -20 °C
pseudo-UTP (100 mM)	Jena Biosience	NU-1139S	stored at -20 °C
QuadroMACS Separator	Miltenyi Biotec	130-090-976	stored at RT
Rat-anti-mouse CD11b antibody, APC-conjugated	BioLegend	101212	stored at 4 °C
Rat-anti-mouse F4/80 antibody, PE-conjugated	eBioscience	12-4801-82	stored at 4 °C
recombinant M-CSF	Peprotech	315-02	stored at -20 °C
RNA purification kit: MEGAclear transcription clean-up kit	ThermoFisher Scientific	AM1908	stored at 4 °C
RNAse-degrading surfactant: RnaseZAP	Sigma-Aldrich	R2020	stored at RT
ultrapure LPS from E.coli O111:B4	Invivogen		stored at -20 °C
Wild type IKKβ plasmid	Addgene	11103	stored at -20 °C
Wild type NEMO plasmid	Addgene	27268	stored at -20 °C