Ett protokoll presenteras för formulering av en blodfri konstgjord kost för att mata Anopheles myggor i fångenskap. Denna kost har en liknande prestanda för att ryggradsdjur blod och utlöser oogenesis och ägg mognad och producerar livskraftig vuxen avkomma.
Malariaforskning kräver storskaliga avels- och produktionsvillkor för myggor (Anopheles spp.) i fångenskap. Den hållbara och tillförlitliga produktionen av myggor hämmas för närvarande av tillgången på färskt ryggradsdjur. Alternativ till blod krävs för att främja effektiva kontrollstrategier för malaria och andra vektorburna sjukdomar som överförs av blodmatningsinsekter. Med detta i åtanke formulerades konstgjordflytande dieter som substitut för färskt ryggradsdjur. Häri rapporterar vi en blodfri konstgjord flytande kost som ger utfodring priser som liknar blod och härmar de fysiologiska effekterna av en färsk ryggradsdjur blod måltid. Kosten inducerar äggstocks- och äggmognad av Anopheles myggor och producerar också god larvöverlevnad och utveckling av funktionella vuxna. Den formulerade blodfria flytande kosten är ett viktigt framsteg mot hållbar myggavel i fångenskap och kommer att minska underhållskostnaderna för myggkolonier och eliminera behovet av färskt ryggradsdjur.
Vektorburna sjukdomar drabbar flera miljoner människor över hela världen och orsakar miljontals dödsfall varje år. De överförs av insekter infekterade med sjukdomsproducerande mikroorganismer (protozoer, virus) som förvärvats när de matar på blod från en smittad värd. Därefter kommer den infekterade vektorn att överföra patogenen till en ny värd under nästa blodmåltid. Malaria är den dödligaste vektorburna sjukdom som överförs av flera olika arter av Anopheles mygga och påverkar 40% av världens befolkning1. Malariaprotistparasiten är ansvarig för mer än 400 000 dödsfall varje år, varav de flesta är barn under 5 år (Världshälsoorganisationen). Den kvinnliga Anopheles myggan överför malaria parasiten av Plasmodium släktet mellan människor och andra djur när den livnär sig på ryggradsdjur blod, ett nödvändigt steg för äggproduktion och utveckling2.
Nuvarande strategier för utrotning av malaria och andra framväxande dödliga mygga vektorburna sjukdomar förlitar sig på utvecklingen av innovativa myggbekämpning strategier3,4,5, som omfattar utsläpp i naturen av ett stort antal myggor uppfödda i insektsmedel. En avgörande begränsande faktor är dock beroendet av en tillförsel av färskt blod för effektiv mygguppfödning och avel. Den varierande sammansättningen av ryggradsdjur blod kan negativt påverka mygga fertilitet och avkomma fitness och kan begränsa tillförlitligheten och hållbarheten hos fångenskap häckningskolonier. Myggutsläpp och kontrollprogram kräver storskaliga myggproduktionssystem och en regelbunden leverans av stora mängder ryggradsdjur. Detta är ett stort hinder för myggproduktion och väcker en rad etiska frågor i samband med användning av levande djur och logistiska begränsningar som orsakas av de tillhörande krävande säkerhetsföreskrifterna. Detta gör kostnaderna för underhåll och säkerhet för myggkolonier höga och utmanar hållbarheten i nuvarande mygguppfödningsmetoder, särskilt i låginkomstländer där hotet om malaria är mycket större.
Nyligen har forskning fokuserats på utvecklingen av blodsubstitut som efterliknar en ryggradsdjur blodmåltid men hittills har endast begränsad framgång uppnåtts6,7,8,9. En framgångsrik konstgjord kost måste (1) provocera full kvinnlig mygga engorgement, (2) utlösa vitellogenin produktion, (3) producera stora partier av livskraftiga ägg, och (4) generera hedande avkomma10. Dessutom har konstgjordkost en standardsammansättning och är därför mer tillförlitliga för produktion av myggor för forsknings- och kontrolländamål. Framgångsrika blodfria dieter har utvecklats för Aedes myggor (granskas av Gonzales och Hansen11) men inte för Anopheles spp. Befintliga konstgjorda dieter innehåller en phagostimulant (t.ex. ATP10), en proteinkälla för äggmognad6,12, kolhydrater som en energikälla, och aminosyror (aa)13 som är grundläggande för äggproduktion och är en viktig begränsande faktor för mygga fertilitet14. En konstgjord blodfri kost måste också ge kolesterol15, vilket förbättrar äggproduktionen. Här beskriver vi en konstgjord blodfri kost för kvinnliga Anopheles myggor och visar att den har en konsekvent och likvärdig prestanda till en högkvalitativ ryggradsdjur blodmåltid.
Framgången för vår formulerade blodfria kost är sannolikt resultatet av den synergistiska fysiologiska effekten av alla komponenter som läggs till i-liq_diet (rik på socker, aminosyror, vitaminer och mikroelement): BSA (proteinkälla), ATP (phagostimulant) och kolesterol (lipidkälla). Tillskott av r-liq_diet med de enskilda komponenterna ensamt var inte effektivt för att stimulera äggproduktion (data som inte visas). En nackdel med protokollet kan vara kostnaden för några av komponenterna, såsom kolesterol. Trots detta är dess närvaro grundläggande, eftersom insekter inte kan syntetisera det19 och denna molekyl är föregångaren till ecdysteroid hormoner som reglerar äggula syntes och ägg mognad i leddjur20. Lägre mängder kolesterol bör testas för att optimera den mängd som behövs i syfte att minska kostnaderna och öka fördelarna med den konstgjorda kosten.
En annan begränsning av metoden är att den konstgjorda kosten måste vara nyberedd från lagerlösningar, som en gång utarbetats i sin slutliga flytande form förlorar den kvalitet efter lagring. I framtiden vår formulerade kost kan förberedas som en torkad makt, liknande SkitoSnackt, en konstgjord blod måltid ersättning för Aedes aegypti myggor21.
Förutom att leverera nödvändiga näringsämnen, en konstgjord måltid måste locka och stimulera kvinnliga myggor att mata på samma sätt som när de livnär sig på ryggradsdjur färskt blod. Den konstgjorda blodfria kosten häri beskrivs resulterade i en 20% ökning av helt engorged kvinnliga myggor jämfört med ryggradsdjur blod matas grupp. Detta indirekta mått på attraktion skulle kunna förtydligas ytterligare genom att använda olfactometrar för att bekräfta att den konstgjorda kosten är mer attraktiv och mer tilltalande för myggor än färskt blod.
Den högsta effekten av kosten på larvdödlighet observerades för larver som härrör från myggor som utfodrats på blod, vilket tyder på att en konstgjord kost av stabil sammansättning kan bidra till att minska dödligheten och förbättra mygga avel framgång jämfört med färskt blod. Det mindre förutsägbara resultatet av en blodmåltid kan uppstå från värdvariationer i sammansättning17 och närvaron i blodet av molekyler som kan störa myggfysiologi22. De föregående fakta betonar fördelarna för högkvalitativa myggor uppfödning av färsk-blodfri kost.
Totalt sett var det genomsnittliga antalet ägg som lades i vår studie lågt i förhållande till dem som rapporterades i vissa insektsmedel, men det genomsnittliga antalet oviposited ägg var jämförbart med A. gambiae laboratorium-uppfödda stam matas på humant blod (22,6 ± 5,5 ägg/ hona)23. Inga signifikanta statistiska skillnader observerades mellan våra experimentella grupper som utfodrats på antingen färskt blod eller på de konstgjorda måltiderna (tabell 2), vilket tyder på att genomförandet av ett artificiellt membranmatningssystem med vår formulerade kost är tillräcklig för att upprätthålla och sprida anofheles myggkolonier i fångenskap.
Konstgjorda blodfria måltider kan upprätthålla Aedes kolonier22, men när de appliceras på Anopheles myggor de är av begränsad eller ingen framgång11. Nyligen beskrevs en plasmabaserad konstgjord måltid för Anopheles myggor24 men utfodringsfrekvensen och reproduktionspotentialen var låg. Våra resultat utgör ett betydande framsteg i toppmodern (granskas av Gonzales och Hansen11)som vår formulerade r-liq_diet hade en liknande eller bättre prestanda än standard ryggradsdjur blod måltid. Ytterligare förbättringar av lagringsstabilitet och lagringskostnader bör utvidga tillämpningsområdets omfattning.
The authors have nothing to disclose.
Vi vill tacka Dinora Lopes (IHMT-NOVA Animal Facility) för teknisk support, Joana Gomes och Ana Catarina Alves (IHMT-NOVA Insectary Facility) för att upprätthålla Anopheles myggkolonier. Finansierat av Bill and Melinda Gates Foundation (OPP1138841), Fundação para a Ciência e Tecnologia (UID/Multi/04413/201, UID/Multi/04326/2013, SFRH/BPD/89811/2012, CEECIND/00450/2017).
Adenosine 5'-triphosphate (ATP) disodium salt hydrate | Sigma Aldrich | A2383 | |
BSA-Bovine Serum Albumin | Sigma Aldrich | A790G | |
Cholesterol | MP Biomedicals | 199342 | |
Dulbecco's modified Eagle's medium (high glucose with L-glutamine) | Lonza Bioscience | BE12-604F | |
Entellan mounting medium | Merck | 1079610100 | |
Glassfeeder | Local glazier | by design | |
Heparin Sodium Salt | Pan Reac AppliChem | A3004,0001 | |
Imalgène 1000 | Merial, Portugal | 01MER122 | |
Needle 20 G x 1" 0.9 x 25 mm needle | Terumo Europe | NN-2025R | |
Parafilm | Sigma Aldrich | P6543-1EA | |
Rompun | Bayer, Portugal | 7427831 | |
Sterilization Millex-HV 0,45 | Millipore | SLHVR25KS | |
Syringe, 1ml, 27 G x ½" 0.4 x 12 mm needle | Terumo Europe | BS-NIN2713 | |
Teich Mix Astra Pond | Astra | 4030733100957 | |
Tetra Goldfish Flakes | Tetra | 4004218742642 |