Summary

Дифференциация мышиной груди Эпителиальная HC11 и EpH4 клетки

Published: February 27, 2020
doi:

Summary

Мы описываем методы индукции двух эпителиальных линий молочной железы, HC11 и EpH4. В то время как оба требуют сыворотки плода теленка, инсулина и пролактина для производства молочных белков, клетки EpH4 могут полностью дифференцироваться в маммосферы в трехмерной культуре. Эти дополнительные модели полезны для исследований трансдукции сигналов дифференциации и неоплазии.

Abstract

Кадхерины играют важную роль в регулировании дифференциации клеток, а также неоплазии. Здесь мы описываем происхождение и методы индукции дифференциации двух линий эпителиальной клеточной клетки молочной железы, HC11 и EpH4, а также их использование для изучения дополнительных этапов развития молочной железы и неопластической трансформации.

Линия эпителиальной клеточной клетки мышки HC11 возникла из молочной железы беременной мыши Balb/c. Он дифференцируется, когда выросли до слияния прилагается к пластиковой поверхности чашки Петри в среде, содержащей сыворотки икроножной железы плода и Hydrocortisone, Insulin и Prolactin (HIP среды). В этих условиях клетки HC11 производят молочные белки и сывороточный кислотный белок (WAP), похожие на лактирующие эпителиальные клетки молочной железы, и образуют рудиментарные молочные железоподобные структуры, называемые «куполами».

Линия клеток EpH4 была получена из спонтанно увековеченных мышей молочной железы эпителиальных клеток, изолированных от беременной бальзам / c мыши. В отличие от HC11, клетки EpH4 могут полностью дифференцироваться в сфероиды (также называемые маммосферы), когда культивируется в трехмерных (3D) условиях роста в среде HIP. Клетки трипсинизированы, подвешены в 20% матрице, состоящей из смеси внеклеточных матричных белков, производимых клетками саркомы мыши Engelbreth-Holm-Swarm (EHS), покрынные поверх слоя концентрированной матрицы, покрывающей пластиковую тарелку Петри или многоцветную пластину, и покрытые слоем 10% матрицы, содержащей HIP среду. В этих условиях клетки EpH4 образуют полые сфероиды, которые демонстрируют апикально-базальную полярность, полый просвет, и производят к-казеин и WAP.

Используя эти методы, наши результаты показали, что интенсивность сигнала cadherin/Rac имеет решающее значение для дифференциации клеток HC11. В то время как Rac1 необходим для дифференциации и низких уровней активированного RacV12 увеличить дифференциацию, высокие уровни RacV12 блокируют дифференциацию, вызывая неоплазию. В отличие от этого, клетки EpH4 представляют собой более раннюю стадию в дифференциации эпителии молочной железы, которая тормозится даже низким уровнем RacV12.

Introduction

В нормальных тканях или опухолях клетки имеют широкие возможности для примыкания к своим соседям в трехмерной организации, и это передразняется в культуре высоким ростом клеток плотности. Клеточная стежка опосредована главным образом через рецепторы кадерин, которые определяют архитектуру клеток и тканей. Интересно, что недавно было продемонстрировано, что кадерины также играют важную роль в трансдукции сигналов, особенно в выживании сигнализации1. Парадоксально, но некоторые из этих клеточных стыковочных сигналов, исследующих из кадерин, были недавно найдены общими как дифференциации и неоплазии2. Здесь мы описываем методы индукции и оценки дифференциации в двух представительных типах эпителиальных клеточных линий молочной железы мыши, HC11 и EpH4.

Линия эпителиальной клеточной линии мыши HC11 может стать полезной моделью для изучения дифференциации эпителиальных клеток. Клетки HC11 являются comMA-1D-производные клеточной линии, происходящих из молочной железы в середине беременной Balb / c мыши3. В отличие от других производных клонов COMMA-1D, клон HC11 не требует экзогенно добавленной внеклеточной матрицы или кокультивации с другими типами клеток для индукции в пробирке эндогенного гена эндогенного гена лактогенными гормонами3. Эта клеточная линия была широко использована в исследованиях дифференциации, потому что она сохранила важные характеристики нормального эпителия молочной железы: клетки HC11 могут частично воссоздать протоковый эпителий в очищенной молочной жирной площадке4. Кроме того, они могут дифференцировать в двумерной (2D) культуры, когда выросли до слияния прилагается к пластиковой поверхности блюда Петри в присутствии стероидов,таких как Hydrocortisone или Дексаметазон, в дополнение к Insulin и Prolactin (HIP средний) не хватает эпидермального фактора роста (EGF), ингибитор дифференциации5,6. В этих условиях клетки HC11 производят молочные белки, такие как к-казеин и WAP, которые обнаруживаются западными промотированием в течение 4 дней после индукции. В то же время, часть клеток HC11 образует рудиментарные молочные железоподобные структуры, называемые «куполами» в стохастической манере. Куполы видны через 4-5 дней после индукции и постепенно увеличиваются в размерах до 10-го дня, что сопутствует увеличению производства к-казеина8. Интересно, что клетки HC11 обладают мутантом p539,и поэтому представляют собой преднеопластическое состояние. По этой причине модель HC11 идеально подходит для изучения сигнальных сетей дифференциации в сочетании с неоплатой в одной и той же клеточной системе.

Клетки EpH4, производные im-2 клеток, являются неопухолевой клеточной линии первоначально полученных от спонтанно увековеченных мыши молочной железы эпителиальных клеток, изолированных от середины беременности Balb / C мыши10. Клетки EpH4 образуют непрерывные эпителиальные монослои в 2D-культуре, но не дифференцируются в железоподобные структуры10,11. Однако, после 3D роста в материале, состоящем из смеси внеклеточных матричных белков, производимых клетками саркомы мыши EHS12 (EHS matrix, matrix, или Matrigel, см. Таблица Материалов),в дополнение к стимуляции с HIP, epH4 клетки могут резюмировать начальные стадии дифференциации молочной железы. В этих условиях клетки EpH4 образуют сфероиды (также называемые маммосферами), которые демонстрируют апикально-базальную полярность и полый просвет, и способны производить молочные белки и WAP, похожие на лактирующие эпителиальные клетки молочной железы. В отличие от клеток HC11, которые являются недифференцированными, а некоторые выражают мезенхимальные маркеры13,клетки EpH4 демонстрируют чисто светлую морфологию14. EpH4 клетки также сообщалось производить молочные белки в 2D культуры путем стимуляции с дексаметазоном, инсулином и пролактином15. Однако такой подход исключает изучение регулятивных эффектов, имитирующих микросреду молочной железы в 3D-культуре.

Protocol

1. Покрытие hC11 Клетки В ламинарном капоте с использованием стерильных методов подготовить бутылку с 50 мл Среды клетки HC11: RPMI-1640 с 10% сыворотки крупного рогатого скота плода (FBS), 5 мкг/мл инсулина, и 10 нг/мл EGF (см. Таблица материалов). Плита приблизительно 400,000 клеток в 3 см …

Representative Results

Давно известно, что дифференциация эпителиальных клеток и адипоцитов требует слияния и вовлечения кадерин2. Мы и другие продемонстрировали, что сливка от клетки к ячейке и вовлечение E- или N-кадерин и кадхерин-11, как происходит с слиянием культивированных клеток, вызывает р…

Discussion

Клетки HC11 идеально подходят для изучения дифференциации в сочетании с неопластической трансформацией. Дополнительным преимуществом является то, что клетки HC11 легко заражаются ретровирусными вектором на основе Mo-MLV для выражения различных генов. В наших руках клетки EpH4 было труднее за…

Divulgations

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Линия клеток HC11 была любезно предоставлена доктором Д. Мединой (Хьюстон, Техас). Авторы благодарны доктору Эндрю Крейгу из Королевского университета за множество реагентов и ценных предложений. Клетки EpH4 были подарком от доктора C. Roskelley (UBC, Ванкувер). Коллин Шик оказала отличную техническую помощь для 3D-культуры исследований.

Финансовая помощь Совета по естественным наукам и инженерным исследованиям Канады (NSERC), Канадских институтов исследований в области здравоохранения (CIHR), Канадского фонда рака молочной железы (CBCF, Онтарио Глава), Канадского альянса исследований рака молочной железы , Онтарио Центры передового опыта, рака молочной железы действий Кингстон (BCAK) и Клэр Нельсон завещание фонда через гранты LR с благодарностью признается. BE получил грантовую поддержку от CIHR, CBCF, BCAK и онкологических исследований общества Инк PTG поддерживается Канады научно-исследовательский председатель, Канадский фонд инноваций, CIHR, NSERC и Канадского онкологического общества. MN была поддержана студентом из Терри Фокс Учебная программа в transdisciplinary исследований рака от NCIC, Высшей премии (ЗГА), и премия декана от Университета королевы. MG была поддержана постдокторской стипендий от армии США рака молочной железы программы, Министерство исследований и инноваций провинции Онтарио и Консультативный исследовательский комитет Королевского университета. VH была поддержана докторской стипендией CBCF и постдокторской стипендией от Программы обучения Фонда Терри Фокса в области трансдисциплинарных онкологических исследований в партнерстве с CIHR. Ханад Адан был получателем летнего обучения NSERC. BS была поддержана наградой выпускника Королевского университета.

Materials

30% Acrylamide/0.8% Bis Solution Bio Rad 1610154 Western Blotting
Anti-Cyclin D1 antibody rabbit, Santa Cruz sc-717 Western Blotting
Anti-p120 antibody mouse, Santa Cruz sc-373751 Western Blotting
Anti-β actin antibody mouse, Cell Signalling technology 3700 Western Blotting
Anti-β casein antibody goat, Santa Cruz Biotechnology sc-17971 Western Blotting
Aprotinin Bio Shop APR600 Lysis Buffer
Bicinchoninic Acid Solution Sigma B9643-1L-KC Protein Determination
Bovine serum albumin Bio Shop ALB007.500 Protein Determination
Clarity Western ECL Substrate Bio Rad 170-5061 Western Blotting
Copper(II) sulphate Sigma C2284-25ML Protein Determination
DAPI Thermofisher Scientific D1306 Staining
Digitonin Calbiochem, Cedarlane Laboratories Ltd 14952-500 Staining
EDTA Bio Shop EDT001.500
Epidermal Growth Factor Sigma E9644 Medium for HC11 Cells
Fetal calf serum PAA A15-751 Cell Culture Medium
Goat- Anti Rabbit-HRP Santa Cruz SC-2004 Western Blotting
Hepatocyte Growth Factor recombinant Gibco PHG0321
Hepes Sigma 7365-45-9 Cell Culture
Horse Anti-Mouse HRP Cell Signalling Technology 7076 Western Blotting
Hydrocortisone Sigma H0888 HIP Medium
insulin Sigma I6634 HIP Medium
Laminar-flow hood BioGard Hood Cell Culture
Leupeptin Bio Shop LEU001.10 Lysis Buffer
Matrix (Engelbreth-Holm-Swarm matrix, Matrigel) Corning CACB 354230
Mouse Anti-Goat HRP Santa Cruz sc-8360 Western Blotting
Mowiol 4-88 Reagent Calbiochem, Cedarlane Laboratories Ltd 475904-100GM Staining
Multi-photon confocal microscope Leica TCS SP2
Na3VO4 Bio Shop SOV850 Lysis Buffer
Na4P207 Sigma 125F-0262 Lysis Buffer
NaCl Bio Shop SOD001.1 Western Blotting
NaF Fisher Scientific 7681-49-4 Lysis Buffer
Nikon digital Camera Coolpix 995
Nitrocellulose Bio Rad 1620112 Western Blotting
NP-40 Sigma 9016-45-9
Paraformaldehyde Fisher Scientific 30525-89-4 Staining
Phase Contrast Microscope Olympus IX70 Cell Culture
Phenylmethylsuphonyl fluoride Sigma 329-98-6 Lysis Buffer
pMX GFP Rac G12V Addgene 14567
Prolactin Sigma L6520 HIP Medium
RPMI-1640 Sigma R8758 Cell Culture Medium
Tissue Culture Dish 35 Sarstedt 83.3900. Cell Culture
Tissue Culture Plate-24 well Sarstedt 83.1836.300 Cell Culture
Transfer Apparatus CBS Scientific Co EBU-302 Western Blotting
Tris Acetate Bio Shop TRA222.500 Western Blotting
Trypsin Sigma 9002-07-7. Cell Culture
Tween-20 Bio Shop TWN510.500 Western Blotting
Veritical Gel Electrophoresis System CBS Scientific Co MGV-202-33 Western Blotting

References

  1. Geletu, M., Guy, S., Arulanandam, R., Feracci, H., Raptis, L. Engaged for survival; from cadherin ligation to Stat3 activation. Jaks-Stat. 2, 27363-27368 (2013).
  2. Niit, M., et al. Regulation of HC11 mouse breast epithelial cell differentiation by the E-cadherin/Rac axis. Experimental Cell Research. 361 (1), 112-125 (2017).
  3. Ball, R. K., Friis, R. R., Schoenenberger, C. A., Doppler, W., Groner, B. Prolactin regulation of beta-casein gene expression and of a cytosolic 120-kd protein in a cloned mouse mammary epithelial cell line. The EMBO Journal. 7 (7), 2089-2095 (1988).
  4. Humphreys, R. C., Rosen, J. M. Stably transfected HC11 cells provide an in vitro and in vivo model system for studying Wnt gene function. Cell growth & differentiation. 8 (8), 839-849 (1997).
  5. Merlo, G. R., et al. differentiation and survival of HC11 mammary epithelial cells: diverse effects of receptor tyrosine kinase-activating peptide growth factors. European Journal of Cell Biology. 70 (2), 97-105 (1996).
  6. Wirl, G., Hermann, M., Ekblom, P., Fassler, R. Mammary epithelial cell differentiation in vitro is regulated by an interplay of EGF action and tenascin-C downregulation. Journal of Cell Science. 108, 2445-2456 (1995).
  7. Arbeithuber, B., et al. Aquaporin 5 expression in mouse mammary gland cells is not driven by promoter methylation. BioMed Research International. 2015, 460598 (2015).
  8. Morrison, B., Cutler, M. L. Mouse Mammary Epithelial Cells form Mammospheres During Lactogenic Differentiation. Journal of Visualized Experiments. (32), e1265 (2009).
  9. Merlo, G. R., et al. Growth suppression of normal mammary epithelial cells by wild-type p53. Oncogene. 9, 443-453 (1994).
  10. Reichmann, E., Ball, R., Groner, B., Friis, R. R. New mammary epithelial and fibroblastic cell clones in coculture form structures competent to differentiate functionally. Journal of Cell Biology. 108 (3), 1127-1138 (1989).
  11. Somasiri, A., Wu, C., Ellchuk, T., Turley, S., Roskelley, C. D. Phosphatidylinositol 3-kinase is required for adherens junction-dependent mammary epithelial cell spheroid formation. Differentiation. 66 (2-3), 116-125 (2000).
  12. Mroue, R., Bissell, M. J. Three-dimensional cultures of mouse mammary epithelial cells. Methods in Molecular Biology. 945, 221-250 (2013).
  13. Williams, C., Helguero, L., Edvardsson, K., Haldosen, L. A., Gustafsson, J. A. Gene expression in murine mammary epithelial stem cell-like cells shows similarities to human breast cancer gene expression. Breast Cancer Research. 11 (3), 26 (2009).
  14. Montesano, R., Soriano, J. V., Fialka, I., Orci, L. Isolation of EpH4 mammary epithelial cell subpopulations which differ in their morphogenetic properties. In Vitro Cellular & Developmental Biology – Animal. 34 (6), 468-477 (1998).
  15. Nagaoka, K., Zhang, H., Watanabe, G., Taya, K. Epithelial cell differentiation regulated by MicroRNA-200a in mammary glands. PLoS One. 8 (6), 65127 (2013).
  16. Arulanandam, R., et al. Cadherin-cadherin engagement promotes survival via Rac/Cdc42 and Stat3. Molecular Cancer Research. 17, 1310-1327 (2009).
  17. Geletu, M., et al. Classical cadherins control survival through the gp130/Stat3 axis. BBA-Molecular Cell Research. 1833, 1947-1959 (2013).
  18. Raptis, L., Arulanandam, R., Geletu, M., Turkson, J. The R(h)oads to Stat3: Stat3 activation by the Rho GTPases. Experimental Cell Research. 317 (13), 1787-1795 (2011).
  19. Raptis, L., et al. Beyond structure, to survival: Stat3 activation by cadherin engagement. Biochemistry and Cell Biology. 87, 835-843 (2009).
  20. Niit, M., et al. Regulation of Differentiation of HC11 Mouse Breast Epithelial Cells by the Signal Transducer and Activator of Transcription-3. Anticancer Research. 39 (6), 2749-2756 (2019).
  21. Brinkmann, V., Foroutan, H., Sachs, M., Weidner, K. M., Birchmeier, W. Hepatocyte growth factor/scatter factor induces a variety of tissue-specific morphogenic programs in epithelial cells. Journal of Cell Biology. 131, 1573-1586 (1995).
  22. Starova, B. . Role of cell adhesion microevironment and the Src/Stat3 axis in autocrine HGF signaling during breast tumourigenesis. , (2008).
  23. Raptis, L., et al. Rasleu61 blocks differentiation of transformable 3T3 L1 and C3HT1/2-derived preadipocytes in a dose- and time-dependent manner. Cell Growth & Differentiation. 8, 11-21 (1997).
  24. Greer, S., Honeywell, R., Geletu, M., Arulanandam, R., Raptis, L. Housekeeping gene products; levels may change with confluence of cultured cells. Journal of Immunological Methods. 355, 76-79 (2010).
  25. Vultur, A., et al. Cell to cell adhesion modulates Stat3 activity in normal and breast carcinoma cells. Oncogene. 23, 2600-2616 (2004).
  26. Debnath, J., Muthuswamy, S. K., Brugge, J. S. Morphogenesis and oncogenesis of MCF-10A mammary epithelial acini grown in three-dimensional basement membrane cultures. Methods. 30 (3), 256-268 (2003).
  27. Lee, G. Y., Kenny, P. A., Lee, E. H., Bissell, M. J. Three-dimensional culture models of normal and malignant breast epithelial cells. Nature Methods. 4 (4), 359-365 (2007).
  28. Hoskin, V. C. . A novel regulatory role of Ezrin in promoting breast cancer cell invasion and metastasis. , (2015).
  29. Su, H. W., et al. Cell confluence-induced activation of signal transducer and activator of transcription-3 (Stat3) triggers epithelial dome formation via augmentation of sodium hydrogen exchanger-3 (NHE3) expression. Journal of Biological Chemistry. 282 (13), 9883-9894 (2007).
  30. Ostrovidov, S., et al. Skeletal muscle tissue engineering: methods to form skeletal myotubes and their applications. Tissue Engineering Part B: Reviews. 20 (5), 403-436 (2014).
  31. Cass, J. . Novel Stat3 and Stat5 pathways in epithelial cell differentiation. , (2013).
check_url/fr/60147?article_type=t

Play Video

Citer Cet Article
Geletu, M., Hoskin, V., Starova, B., Niit, M., Adan, H., Elliott, B., Gunning, P., Raptis, L. Differentiation of Mouse Breast Epithelial HC11 and EpH4 Cells. J. Vis. Exp. (156), e60147, doi:10.3791/60147 (2020).

View Video