Micro-aspiration à cellule unique comme stratégie alternative au tri cellulaire activé par fluorescence pour la séparation du mélange de virus géants

Summary

Ici, nous décrivons une méthode de micro-aspiration de cellules simples pour la séparation des amibes infectées. Afin de séparer les sous-populations virales de Vermamoeba vermiformis infectés par des Faustovirus et des virus géants inconnus, nous avons développé le protocole détaillé ci-dessous et démontré sa capacité à séparer deux nouveaux virus géants à faible abondance.

Abstract

Pendant le processus de co-culture de l'amibe, plus d'un virus peut être isolé dans un seul puits. Nous avons précédemment résolu ce problème par dilution de point final et/ou tri activé de cellules de fluorescence (FACS) appliqué à la population virale. Cependant, lorsque les virus dans le mélange ont des propriétés morphologiques similaires et que l'un des virus se multiplie lentement, la présence de deux virus est découverte au stade de l'assemblage du génome et les virus ne peuvent pas être séparés pour une autre caractérisation. Pour résoudre ce problème, nous avons développé une procédure de micro-aspiration à cellule unique qui permet la séparation et le clonage de virus très similaires. Dans le présent travail, nous présentons comment cette stratégie alternative nous a permis de séparer les petites sous-populations virales de Clandestinovirus ST1 et Usurpativirus LCD7, virus géants qui se développent lentement et ne conduisent pas à la lyse amiale par rapport à la lytique et à croissance rapide Le Faustovirus. Le contrôle de pureté a été évalué par amplification spécifique de gène et des virus ont été produits pour davantage de caractérisation.

Introduction

Les virus nucléocytoplasmiques de gros virus d'ADN (NCLDV) sont extrêmement divers, définis par quatre familles qui infectent des eucaryotes¹. Les premiers virus décrits avec des génomes supérieurs à 300 kbp étaient Phydcodnaviridae, y compris Paramecium bursaria Chlorella virus 1 PBCV1². L'isolement et la première description de Mimivirus, a montré que la taille des virus a doublé en termes à la fois de la taille de la particule (450 nm) et la longueur du génome (1,2 Mo)³. Depuis lors, de nombreux virus géants ont été décrits, généralement isolés à l'aide d'une procédure de co-c....

Protocol

1. Culture Amoeba

1. Utilisez Vermamoeba vermiformis (souche CDC19) comme support cellulaire.
2. Ajouter 30 ml de protéase-peptone-levure extrait-glucose milieu (PYG) (tableau 1) et 3 ml d'amibes à une concentration de 1 x 10⁶ cellules/mL dans un flacon de culture cellulaire de 75 cm^2.
3. Maintenir la culture à 28 oC.
4. Après 48 h, quantifier les amibes à l'aide de diapositives de comptage.
5. Pour rincer, récolter les cellules à une concentration de 1 x 10⁶ cellules/mL et granuler les amibes par centrifugation à 720 x g pendant 10 min. Retirez le supernatant et sus....

Results

La micro-aspiration à cellule unique est un processus de micromanipulation optimisé dans ce manuscrit (figure 1). Cette technique permet la capture d'une amibe arrondie et infectée (figure 2A) et sa libération dans une nouvelle plaque contenant des amibes non infectées (figure 2). Il s'agit d'un prototype fonctionnel qui s'applique au système de co-culture et a réussi à isoler les virus géants non-lytiques. Cette ap.......

Discussion

La durée de la manipulation de micro-aspiration à cellule unique et son bon fonctionnement dépendent de l'opérateur. Les différentes étapes de l'expérience exigent de la précision. L'utilisation des composants de micromanipulation du poste de travail doit être sous contrôle constant en observant le processus de micro-aspiration et la libération de la cellule. Le suivi par observation microscopique est nécessaire pour la capture et le transfert d'une cellule. Un opérateur expérimenté peut prendre 1 à 2 h pour isoler 10 ce.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Agarose Standard	Euromedex	Unkown	Standard PCR
AmpliTaq Gold 360 Master Mix	Applied Biosystems	4398876	Standard PCR
CellTram 4r Oil	Eppendorf	5196000030	Contrôlez les cellules pendant le processus de microaspiration
Flacons de culture cellulaire Corning 150 cm2	Sigma-aldrich	CLS430825	Culture
Fioles de culture cellulaire Corning 25 cm2	Sigma-aldrich	CLS430639	Culture
		Corning flacons de culture cellulaire 75 cm2	Sigma-aldrich
Caméra DFC 425C LEICA		Unkown	Observation/Monitoring
Eclipse TE2000-S Microscope inversé	Nikon	Unkown	Observation/Monitoring
EZ1 avancé XL	Quiagen	9001874	Extraction d’ADN
Glasstic Slide 10 avec grilles de comptage	Kova International	87144E	Comptage cellulaire
Mastercycler nexus	Eppendorf	6331000017	Standard
PCR Microcapillaire 20 & micro ; m	Eppendorf	5175 107.004	Microaspiration et libération de cellules
Micromanipulateur InjectMan NI2	Eppendorf	631-0210	Positionnement microcapillaire
Eau sans nucléase	ThermoFischer	AM9920	PCR standard
Optima XPN Ultracentrifugeuse	BECKMAN COULTER	A94469	Purification du virus
Boîte de Pétri 35 mm	Ibidi	81158	Culture/observation
Filtres stériles pour seringues 5 & micro ; m	Sigma-aldrich	SLSV025LS	Filtration
SYBR vert Type I	Invitrogen	inconnu	Sondes moléculaires fluorescentes/cytométrie en flux
SYBR Safe	Invitrogen	S33102	PCR standard ; Coloration au gel d’ADN
Tecnai G20	FEI	Unkown	Microscopie électronique
Type 70 Ti Rotor à angle fixe en titane	BECKMAN COULTER	337922	Purification du virus
Tube ultra-transparent, 25 x 89 mm2	BECKMAN COULTER	344058	Purification du virus