HIV標的の抗体依存性細胞性性性過小細胞症アッセイにおけるヒト母乳からの白球細胞の単離
Summary
母乳はヒト免疫不全ウイルス(HIV)を伝播するが、HIVに感染した母親によって授乳された乳児の約15%だけが感染する。母乳で育てられた乳児は毎日〜105−108母性白血病を摂取するが、これらの細胞は研究されている。ここでは、母乳白球の単離と、その間に行能力の分析について説明する。
Abstract
抗レトロウイルス薬がなくても、HIVに感染した母親によって授乳された乳児の約15%のみが感染し、母乳(BM)の強力な保護効果を示唆している。清潔な水と適切な乳児用の処方へのアクセスが信頼できる場合を除き、WHOはHIVに感染した母親のための母乳育児の中止を推奨しません。BM伝送を減らすために、多くの要因が連携して動作する可能性が高い。母乳で育てられた乳児は毎日〜105−108母性白血病を摂取し、大部分は不明であるが、これらの細胞がBMの抗ウイルス性に対する寄与である。抗体依存性細胞性細胞細胞症(ADCP)は、HIV標的に対するBMファゴサイトによる最も本質的かつ広範な自然免疫応答の1つである。細胞を授乳の様々な段階で得られた5つのヒトBMサンプルから単離した。分離は穏やかな遠心分離を介して行われ、続いて乳脂肪を注意深く除去し、細胞ペレットを繰り返し洗浄した。HIVエンベロープ(Env)エピトープでコーティングされた蛍光ビーズをADCPの分析対象として用いた。細胞をCD45表面マーカーで染色し、白血病を同定した。ADCP活性は、HIV特異的抗体830Aを用いて対照実験を上回り、再現可能に測定可能であることが判明した。
Introduction
ヒト母乳(BM)は、>90%生存可能な母細胞で構成されています。細胞組成物は、授乳の段階、母子および乳児の健康状態、および個々の変動によって強く影響を受け、1、2、3、4の理解が不十分なままである。BMが~103−105白血病/mLを含有することを考えると、母乳で育てられた乳児が毎日〜105−108母性白血病を毎日摂取すると推定できる。様々な生体内白球が乳児に重要な免疫を提供し、初期摂取5、6、7、8のこれらの部位をはるかに超えて機能的であることを実証した。 ,9,10,11.乳児によって摂取されたすべての母体由来細胞は、乳児自身の白血病細胞12と一緒に免疫機能を実行する可能性を有する。
ヒト免疫不全ウイルス(HIV)の母子感染(MTCT)は、資源に限られた国では依然として危機的状況にある。下痢や呼吸器疾患は、資源に限られた国の乳児の死亡率の実質的な割合を占めており、これらの病気は排他的な母乳育児によって大幅に減少し、HIVに感染した母親への利益母乳育児はリスク13、14、15をはるかに上回る。きれいな水と適切な乳児用製剤へのアクセスが信頼できる場合を除き、WHOはHIVに感染した母親のための母乳育児の中止を推奨していません16.毎年約 100,000 の MtCT が BM 経由で発生します。しかし、HIVに感染した母親によって授乳された乳児の約15%のみが感染し、BM 17、18、19、20、21の強力な保護効果を示唆している。多くの要因は、伝送を防ぐために連携して動作する可能性が高いです。重要なことに、BMにおけるHIV特異的抗体(Abs)は、HIV感染によるMTCTの減少および/または乳児死亡の減少と相関している22,23である。主に不明なのは、BMの細胞画分がその抗ウイルス性に対する寄与である。
多くのAbsは、免疫グロブリン分子の「一定」領域、結晶化性断片(Fc)、事実上すべての自然免疫細胞に見られるFc受容体(FcR)との相互作用を介して媒介する様々な抗ウイルス活性を促進し、事実上その全てヒトBM24で見つかった.抗体依存性細胞性細胞症(ADCP)は、ウイルス感染のクリアランスのために必要に応じて実証されており、HIV25、26、27のMTCTの予防の場合に研究されている。28歳,29.BMファゴサイトによるHIVのMTCTの予防に対するADCP活性の潜在的な寄与に関する知識の不足を考慮し、細胞媒介性ADCPの研究を行うために、ヒトBMから細胞を単離する厳格な方法を開発することを目指した。BMは授乳の様々な段階で得られる。
Protocol
この研究の各参加者は、IRB承認を使用してシナイ山のヒト被験者保護プログラム(PPHS)の指導と承認を受けて、倫理的および制度的レビュー委員会(IRB)の承認に合わせて募集され、インタビューを受けました。母乳サンプルを得るためのプロトコル。 1. ターゲットマイクロスフィアの準備 関連する標的抗原を選択します。注:この例では?…
Representative Results
牛乳は室温またはクーラーで保つことができます(ただし、凍結していません)。しかし、牛乳が非常に冷たく保たれている場合の生存率が低下していることを考えると(データは示されていない)、周囲の温度で採取、保存、輸送が簡単であることを考えると、サンプルを減らすために冷蔵しないことをお勧めします。サンプル間の変動性。7−183日分娩後に得られた牛?…
Discussion
ここに記載されているADCP活性を測定するためのフローサイトメトリーベースの技術は、最初に201130に記載され、それ以来、80以上の研究で堅牢であることが証明され、引用されています。ここで説明するプロトコルは、この手法を初めて一次 BM セルで使用するために適応します。BM細胞によるFc媒介機能の以前の研究は、大きく異形成後(生後0−4日)から分離された細胞を用?…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
シナイ山のイカーン医学部の医学科と微生物学科のスーザン・ゾラ・パズナー博士に原稿のレビューを感謝します。NIH/NICHDは、補助金番号R21 HD095772-01A1の下で、このプロジェクトのための資金を提供しました。また、R.パウエルは、シナイ山のイカーン医学部感染症学科医学部の資金によって支援されました。
Materials
| 1 µm FluoSpheres NeutrAvidin-Labeled Microspheres | Thermo Fisher | F8776 | |
| BD Pharmingen PE Mouse Anti-Human CD45 | BD | 560975 | |
| Bovine serum Albumin | MP Biomedicals | 8810025 | |
| Corning V-bottom polystyrene 96-well plate | Corning | 3894 | |
| Cytochalasin D | Sigma | 22144-77-0 | |
| EZ-Link NHS-LC-LC-Biotin kit | Thermo Fisher | 21338 | |
| Falcon 15mL Conical Centrifuge Tubes | Corning | 352196 | |
| Falcon 50mL Conical Centrifuge Tubes | Corning | 352070 | |
| Fixable Viability Stain 450 | BD | 562247 | |
| Formaldehyde solution | Sigma | 252549 | |
| HBSS without Calcium, Magnesium or Phenol Red | Life Technologies | 14175-095 | |
| Human BD Fc Block | BD | 564219 | |
| Human Serum Albumin | MP Biomedicals | 2191349 | |
| Kimtech Science Kimwipes Delicate Task Wipers | Kimberly-Clark Professional | 34120 | |
| PBS 1x pH 7.4 | Thermo Fisher | 10010023 | |
| Polystyrene 10mL Serological Pipettes | Corning | 4488 | |
| Protein Concentrators PES, 3K MWCO, 0.5 mL | Pierce | 88512 |
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Citer Cet Article
Powell, R. L., Fox, A. Isolation of Leukocytes from Human Breast Milk for Use in an Antibody-dependent Cellular Phagocytosis Assay of HIV Targets. J. Vis. Exp. (151), e60149, doi:10.3791/60149 (2019).