En fluorescens-basert analyse for karakterisering og kvantifisering av lipid dråpe dannelse i Human intestinal Organoids
Summary
Denne protokollen beskriver en analyse for karakterisering av lipid dråpe (LD) formasjon i menneskets intestinal organoids upon stimulering med fettsyrer. Vi diskuterer hvordan denne analysen brukes til kvantifisering av LD-formasjonen, og hvordan den kan brukes til screening med høy gjennomstrømming for legemidler som påvirker LD-formasjonen.
Abstract
Fôr lipider er tatt opp som frie fettsyrer (FAs) av tarm epitel. Disse FAs er intracellulært omgjort til triglyserider (TG) molekyler, før de er pakket inn i chylomicrons for transport til lymfe eller inn cytosolic lipid dråper (LDs) for intracellulære lagring. Et avgjørende skritt for dannelsen av LDs er katalysator for diacylglycerol acyltransferases (DGAT) i det siste trinnet av TG-syntese. LDs er viktig å buffer giftige lipid arter og regulere cellulær metabolisme i ulike celletyper. Siden det menneskelige tarm epitel er regelmessig konfrontert med høye konsentrasjoner av lipider, er LD formasjon av stor betydning for å regulere homeostase. Her beskriver vi en enkel analyse for karakterisering og kvantifisering av LD-formasjonen (LDF) ved stimulering med de vanligste umettede fettsyrer, oljesyre syre, i Human intestinal organoids. LDF-analysen er basert på det LD-spesifikke fluorescerende fargestoffet LD540, som gjør det mulig for kvantifisering av LDs ved konfokalmikroskopi mikroskopi, fluorescerende plate leser eller flyt flowcytometri. LDF-analysen kan brukes til å karakterisere LD-formasjonen i humane tarm epitelceller, eller til å studere menneskelige (genetiske) lidelser som påvirker LD-metabolismen, for eksempel DGAT1-mangel. Videre kan denne analysen også brukes i en høy gjennomstrømming rørledning for å teste romanen terapeutiske forbindelser, som gjenoppretter defekter i LD formasjon i intestinal eller andre typer organoids.
Introduction
Lipider er en avgjørende del av menneskets kosthold og spiller en viktig rolle i systemisk energilagring og metabolisme. Når svelget, er kosttilskudd lipider degradert til frie fettsyrer (FFAs) og monoglyserider (MGs) av bukspyttkjertelen lipaser. Disse underlag blir så tatt opp av enterocytes av tarm epitel, hvor de først re-forestret til diglyserider (DG) av monoglyceride acyltransferases (MGAT) enzymer og senere til triglyserider (TG) ved diacylglycerol acyltransferase 1 (DGAT1)1. Til slutt, disse TGS er integrert i enten chylomicrons for eksport til lymfe systemet eller cytosolic lipid dråper (LDs) for intracellulære lagring2,3. Selv om chylomicrons er nødvendig for å distribuere kosttilskudd lipider til andre organer, er viktigheten av intracellulære fett lagring i LDs ikke helt klart. Imidlertid har LDs vist seg å utføre en regulerende funksjon i tarmen, da de langsomt slipper lipider inn i sirkulasjonen opp til 16 timer etter et måltid4. Videre har LDs blitt vist å beskytte mot giftige fatty acid konsentrasjoner, slik som i musen adipocytter under lipolytic forhold5.
DGAT1-proteinet er plassert på endoplasmatiske retikulum (ER)-membranen og spiller en avgjørende rolle i LD-formasjonen i tarm epitel. Homozygote mutasjoner i DGAT1 føre til tidlig utbruddet alvorlig diaré og/eller oppkast, hypoalbuminemia, og/eller (dødelig) protein-å miste intoleranse med intestinal svikt på fett inntak, illustrerer viktigheten av DGAT1 i lipid homeostase av den menneskelige intestinal epitel6,7,8,9,10. Siden forekomsten av DGAT1-mangel hos mennesker er sjelden, har tilgang til primære pasient-avledede celler vært knappe. Videre har den langsiktige kulturen i tarm epitelceller lenge vært begrenset til tumor-avledet cellelinjer som representerer normal fysiologi bare til en begrenset forlenge. Derfor har DGAT1-mediert ld-formasjon hovedsakelig blitt studert i fibroblaster eller animalsk avledede cellelinjer7,10,11,12. Slik, det ble nylig vist at DGAT1-mangelfull pasient-avledet fibroblaster akkumuleres mindre LDs sammenlignet med sunne kontroll celler etter stimulering med oljesyre acid (OA)8.
Tidligere ble protokoller etablert for å kultur epitel stamceller fra alle Gastrointestinal organ i form av tredimensjonale (3D) organoids13. Disse intestinal organoids kan oppbevares i kultur i lang tid13, og tillate funksjonell studie av pasient-og intestinal location-spesifikke epitel egenskaper14. De er genetisk og phenotypically stabile og kan oppbevares, slik at lang tids ekspansjon og biobanking13.
Vi har nylig demonstrert at LD-formasjonen lett kan måles i humant intestinal organoids i en LD-formasjon (LDF)-analysen6. Når de utsettes for OA for 16 h, organoids generere LDs å beskytte cellene fra lipid-indusert toksisitet. Når OA konsentrasjonen er for høy, cellene dør av ordtak-mediert apoptose6. LDF-analysen ble tidligere vist å være i stor grad avhengig av DGAT1 som indikert av organoids avledet fra DGAT1-mutant pasienter og ved bruk av DGAT1-spesifikke hemmere6.
For LDF analysen beskrevet i detalj her, 3D organoids er kultivert fra intestinal biopsier og er passert ukentlig ved avbrudd i enkeltceller som lett danner nye organoids. For å kjøre LDF analysen, er ~ 7 500 organoid-avledet enkeltceller belagt i hver brønn av en 24-brønn plate. Organoids dannes over flere dager, inkubert over natten med 1 mM OA og beiset med LD540, en fluorescerende celle gjennomtrengelig LD-spesifikk fargestoff som forenkler bildebehandling. LD-formasjonen kvantifisert deretter av konfokalmikroskopi mikroskopi, fluorescerende plate leser eller strømnings flowcytometri.
Ved å skalere denne LD-formasjonen til et 96-format, kan analysen også brukes til analyse av LD-formasjonen med høy gjennomstrømming til skjermen for nye legemidler som påvirker LD-formasjonen i menneskelige tarm organoid kulturer, eller for å studere (menneskelige genetiske) lidelser som påvirker LD metabolisme.
Protocol
Representative Results
Discussion
Her gir vi en protokoll for å bestemme LD formasjon i menneskets intestinal organoids upon inkubasjons med oljesyre syre. Denne metoden er basert på LD-spesifikke fluorescerende fargestoff LD54018, som gjør det mulig for karakterisering og kvantifisering av det totale volumet av lipid dråper i en organoid kultur. Prosedyrene for å etablere og vedlikeholde menneskelige intestinal organoid kulturer har blitt publisert før13, og en visuell guide av denne protokollen er t…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Vi takker B. Spee for sjenerøst gir LD540. Dette arbeidet ble støttet av en Nederland organisasjon for Scientific Research stipend (NWO-ZonMW; VIDI 016.146.353) til S.M.
Materials
| Advanced DMEM/F12 | Gibco | 12634-028 | |
| B27 supplement | Gibco | 17504-044 | |
| Basement membrane matrix (matrigel) | BD Biosciences | 356231 | |
| DAPI | Sigma-Aldrich | D9542-1MG | |
| DGAT1 inhibitor (AZD 3988) | Tocris Bioscience | 4837/10 | |
| Fatty acid free BSA | Sigma-Aldrich | A7030 | |
| Formaldehyde | Klinipath | 4078-9001 | |
| Glutamin (GlutaMAX, 100X) | Gibco | 15630-056 | |
| HEPES (1 M) | Gibco | 15630-080 | |
| laser scanning confocal microscope | Leica | SP8X | |
| LD540 | kindly provided by Dr. B. Spee, Utrecht University | ||
| mEGF | Peprotech | 315-09_500ug | |
| N-acetyl cysteine | Sigma-Aldrich | A9165-100G | |
| Nicotinamide | Sigma-Aldrich | N0636-500G | |
| Noggin producing cells (HEK293-mNoggin-Fc cells) | MTA with J. den Hertog, Hubrecht Institute | ||
| Oleic acid | Sigma-Aldrich | O1008-5G | |
| p38 MAPK inhibitor (p38i) (SB202190) | Sigma-Aldrich | S7067-25MG | |
| PBS | Sigma-Aldrich | D8662-500ML | |
| PBS without Ca2+/Mg2+ | Sigma-Aldrich | D8537-500ML | |
| Penicillin-Streptomycin (5,000 U/ml) | Gibco | 15070-063 | |
| R-spondin producing cells (Cultrex HA-R-Spondin1-Fc 293T Cells) | R&D systems | 3710-001-01 | |
| TC-treated 24 well plates | Greiner-One | 662160 | |
| TC-treated black clear-bottom 96 well plates | Corning Life Sciences | 353219 | |
| TGFb type I receptor inhibitor (A83-01) | Tocris Bioscience | 2939/10 | |
| Trypsin (TrypLE Express) | Life Technologies | 12604021 | |
| WNT-3A producing cells (L-Wnt-3A cells) | MTA with J. den Hertog, Hubrecht Institute | ||
| Y-27632 dihydrochloride (Rho kinase inhibitor) | Abcam | ab120129-10 |
References
- Yen, C. L. E., Nelson, D. W., Yen, M. I. Intestinal triacylglycerol synthesis in fat absorption and systemic energy metabolism. Journal of Lipid Research. 56 (3), 489-501 (2015).
- Yen, C. L. E., Stone, S. J., Koliwad, S., Harris, C., Farese, R. V. Thematic review series: glycerolipids. DGAT enzymes and triacylglycerol biosynthesis. Journal of Lipid Research. 49 (11), 2283-2301 (2008).
- D’Aquila, T., Hung, Y. H., Carreiro, A., Buhman, K. K. Recent discoveries on absorption of dietary fat: Presence, synthesis, and metabolism of cytoplasmic lipid droplets within enterocytes. Biochimica et Biophysica Acta. 1861 (8 Pt A), 730-747 (2016).
- Chavez-Jauregui, R. N., Mattes, R. D., Parks, E. J. Dynamics of fat absorption and effect of sham feeding on postprandial lipema. Gastroenterology. 139 (5), 1538-1548 (2010).
- Chitraju, C., et al. Triglyceride Synthesis by DGAT1 Protects Adipocytes from Lipid-Induced ER Stress during Lipolysis. Cell Metabolism. 26 (2), 407-418 (2017).
- van Rijn, J. M., et al. Intestinal failure and aberrant lipid metabolism in patients with DGAT1 deficiency. Gastroenterology. 1, 130-143 (2018).
- Haas, J. T., et al. DGAT1 mutation is linked to a congenital diarrheal disorder. Journal of Clinical Investigation. 122 (12), 4680-4684 (2012).
- Gluchowski, N. L., et al. Identification and characterization of a novel DGAT1 missense mutation associated with congenital diarrhea. Journal of Lipid Research. 58 (6), 1230-1237 (2017).
- Ratchford, T. L., Kirby, A. J., Pinz, H., Patel, D. R. Congenital Diarrhea From DGAT1 Mutation Leading to Electrolyte Derangements, Protein-losing Enteropathy, and Rickets. Journal of Pediatric Gastroenterology and Nutrition. 66 (3), e82-e83 (2018).
- Stephen, J., et al. Congenital protein losing enteropathy: an inborn error of lipid metabolism due to DGAT1 mutations. European Journal of Human Genetics. 24 (9), 1268-1273 (2016).
- Schlegel, C., et al. Reversible deficits in apical transporter trafficking associated with deficiency in diacylglycerol acyltransferase. Traffic (Copenhagen, Denmark). 19 (11), 879-892 (2018).
- Wilfling, F., et al. Triacylglycerol synthesis enzymes mediate lipid droplet growth by relocalizing from the ER to lipid droplets. Developmental Cell. 24 (4), 384-399 (2013).
- Sato, T., et al. Long-term expansion of epithelial organoids from human colon, adenoma, adenocarcinoma, and Barrett’s epithelium. Gastroenterology. 141 (5), 1762-1772 (2011).
- Middendorp, S., et al. Adult stem cells in the small intestine are intrinsically programmed with their location-specific function. Stem Cells. 32 (5), 1083-1091 (2014).
- Boj, S. F., et al. Forskolin-induced Swelling in Intestinal Organoids: An In Vitro Assay for Assessing Drug Response in Cystic Fibrosis Patients. Journal of Visualized Experiments. (120), e55159 (2017).
- Schindelin, J., et al. Fiji: an open-source platform for biological-image analysis. Nature Methods. 9 (7), 676-682 (2012).
- Rueden, C. T., et al. ImageJ2: ImageJ for the next generation of scientific image data. BMC Bioinformatics. 18 (1), 529 (2017).
- Spandl, J., White, D. J., Peychl, J., Thiele, C. Live cell multicolor imaging of lipid droplets with a new dye, LD540. Traffic. 10 (11), 1579-1584 (2009).
- Hung, Y. H., Carreiro, A. L., Buhman, K. K. Dgat1 and Dgat2 regulate enterocyte triacylglycerol distribution and alter proteins associated with cytoplasmic lipid droplets in response to dietary fat. Biochimica et Biophysica Acta – Molecular and Cell Biology of Lipids. 1862 (6), 600-614 (2017).
