En Fluorescensbaserad analys för karakterisering och kvantifiering av Lipidbildningen hos humana intestinala Organoider
Summary
Detta protokoll beskriver en analys för karakterisering av lipid DROPP (LD) formation i mänskliga intestinal organoider vid stimulering med fettsyror. Vi diskuterar hur denna analys används för kvantifiering av LD-bildning, och hur den kan användas för hög genomströmning screening för läkemedel som påverkar LD-bildning.
Abstract
Dietary lipider tas upp som fria fettsyror (FAs) av intestinal epitel. Dessa fas är intracellulärt omvandlas till triglycerid (TG) molekyler, innan de förpackas i kylomikroner för transport till lymfa eller i cytosoliska lipiddroppar (LDs) för intracellulär lagring. Ett avgörande steg för bildandet av LDs är den katalytiska aktiviteten av diacylglycerolacyltransferaser (DGAT) i det sista steget i TG-syntesen. LDs är viktiga för att buffra giftiga lipidarter och reglera cellulär metabolism i olika celltyper. Eftersom den mänskliga intestinal epitel regelbundet konfronteras med höga koncentrationer av lipider, LD formation är av stor betydelse för att reglera homeostas. Här beskriver vi en enkel analys för karakterisering och kvantifiering av LD formation (LDF) vid stimulering med de vanligaste omättade fettsyror, oljesyra, i mänskliga intestinal organoider. LDF-analysen är baserad på det LD-specifika fluorescerande färgämnet LD540, som möjliggör kvantifiering av LDs genom konfokalmikroskopi, fluorescerande Plattläsare eller flödescytometri. LDF-analysen kan användas för att karakterisera LD-bildningen i humana intestinala epitelceller, eller för att studera mänskliga (genetiska) sjukdomar som påverkar LD-metabolism, såsom DGAT1-brist. Dessutom kan denna analys också användas i en hög genomströmning pipeline för att testa nya terapeutiska föreningar, som återställer defekter i LD-bildning i tarm eller andra typer av organoider.
Introduction
Lipider är en viktig del av den mänskliga kosten och spelar en stor roll i systemisk energilagring och metabolism. När intas, Dietary lipider bryts ned till fria fettsyror (FFAs) och monoglycerider (MGS) av pankreaslipaser. Dessa substrat tas sedan upp av enterocyterna i tarmens epitel, där de först återförestrades till diglycerider (DG) av monoglyceride acyltransferaser (mgat) enzymer och därefter till triglycerider (TG) av diglyceridolja acyltransferas 1 (DGAT1)1. Slutligen är dessa TGS integreras i antingen kylomikroner för export till lymfsystemet eller cytosoliska lipid droppar (LDs) för intracellulär lagring2,3. Även om kylomikroner behövs för att distribuera kosten lipider till andra organ, är vikten av intracellulär fett lagring i LDs inte helt klart. Emellertid, LDs har visat sig utföra en reglerande funktion i tarmen, som de långsamt släpper lipider i cirkulationen upp till 16 h efter en måltid4. Dessutom har LDs visats skydda mot giftiga fettsyra koncentrationer, såsom i mus adipocyter under lipolytiska förhållanden5.
Den DGAT1 proteinet är lokaliserat på det endoplasmatiska nätmagen (er) membran och leker en avgörande roll i LD bildning inne om intestinal epitel. Homozygot mutationer i DGAT1 leda till tidig debut svår diarré och/eller kräkningar, hypoalbuminemi, och/eller (dödlig) protein-Losing enteropati med intestinal misslyckande vid fettintag, illustrerar vikten av DGAT1 i lipidhomeostas av den mänskliga intestinal epitel6,7,8,9,10. Eftersom förekomsten av DGAT1-brist hos människor är sällsynt, tillgång till primära patient-härledda celler har varit knappa. Vidare, den långsiktiga kulturen av intestinal epitelceller har länge begränsats till tumör-härledda cellinjer som representerar den normala fysiologin endast till en begränsad utvidga. Därför, DGAT1-medierad LD formation har mestadels studerats i fibroblaster eller djur-härledda cellinjer7,10,11,12. Som sådan, det visades nyligen att DGAT1-bristfällig patient-derived fibroblaster ackumuleras mindre LDs jämfört med friska kontrollceller efter stimulering med oljesyra (OA)8.
Tidigare, protokoll upprättades för att kulturen epiteliala stamceller från alla gastrointestinala organ i form av tredimensionella (3D) organoider13. Dessa intestinala organoider kan hållas i kulturen under en lång tidsperiod13, och möjliggöra funktionell studie av patient-och tarm platsspecifika epiteliala egenskaper14. De är genetiskt och fenotypiskt stabila och kan lagras, vilket möjliggör långsiktig expansion och biobankning13.
Vi har nyligen visat att LD formation lätt kan mätas i mänskliga intestinala organoider i en LD formation (LDF) assay6. När organoider exponeras för OA under 16 timmar, genererar de LDs för att skydda cellerna från lipidinducerad toxicitet. När OA koncentrationer är för höga, cellerna dör av kaspas-medierad apoptos6. LDF-analysen har tidigare visat sig vara i hög grad beroende av DGAT1, vilket indikeras av organoider som härrör från DGAT1-muterade patienter och genom användning av DGAT1-specifika hämmare6.
För LDF-analysen som beskrivs i detalj här, är 3D-organoider odlade från intestinal biopsier och är framryckt varje vecka genom störningar i enskilda celler som lätt bildar nya organoider. För att köra LDF-analysen, ~ 7 500 Organoid-härledda enskilda celler är klädd i varje brunn av en 24-brunn tallrik. Organoider bildas under flera dagar, inkuberas över natten med 1 mM OA och färgas med LD540, en fluorescerande cell-permeable LD-specifik färg som underlättar avbildning. LD-bildningen kvantifieras sedan genom konfokalmikroskopi, fluorescerande Plattläsare eller flödescytometri.
Genom att skala denna LD formation assay till en 96-väl format, kan analysen också användas för hög genomströmning analys av LD formation till Screen för nya läkemedel som påverkar LD formation i mänskliga intestinala Organoid kulturer, eller att studera (mänskliga genetiska) störningar som påverkar LD metabolism.
Protocol
Representative Results
Discussion
Här ger vi ett protokoll för att bestämma LD formation i mänskliga intestinal organoider vid inkubering med oljesyra. Denna metod är baserad på LD-specifika fluorescerande färgämne LD54018, vilket möjliggör karakterisering och kvantifiering av den totala volymen av lipiddroppar inom en Organoid kultur. Förfarandena för att etablera och underhålla humana intestinala Organoid kulturer har publicerats före13, och en visuell guide till detta protokoll finns också…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Vi tackar B. Spee för generöst tillhandahålla LD540. Detta arbete stöddes av en nederländsk organisation för vetenskapligt forskningsbidrag (NWO-ZonMW; VIDI 016.146.353) till Swen
Materials
| Advanced DMEM/F12 | Gibco | 12634-028 | |
| B27 supplement | Gibco | 17504-044 | |
| Basement membrane matrix (matrigel) | BD Biosciences | 356231 | |
| DAPI | Sigma-Aldrich | D9542-1MG | |
| DGAT1 inhibitor (AZD 3988) | Tocris Bioscience | 4837/10 | |
| Fatty acid free BSA | Sigma-Aldrich | A7030 | |
| Formaldehyde | Klinipath | 4078-9001 | |
| Glutamin (GlutaMAX, 100X) | Gibco | 15630-056 | |
| HEPES (1 M) | Gibco | 15630-080 | |
| laser scanning confocal microscope | Leica | SP8X | |
| LD540 | kindly provided by Dr. B. Spee, Utrecht University | ||
| mEGF | Peprotech | 315-09_500ug | |
| N-acetyl cysteine | Sigma-Aldrich | A9165-100G | |
| Nicotinamide | Sigma-Aldrich | N0636-500G | |
| Noggin producing cells (HEK293-mNoggin-Fc cells) | MTA with J. den Hertog, Hubrecht Institute | ||
| Oleic acid | Sigma-Aldrich | O1008-5G | |
| p38 MAPK inhibitor (p38i) (SB202190) | Sigma-Aldrich | S7067-25MG | |
| PBS | Sigma-Aldrich | D8662-500ML | |
| PBS without Ca2+/Mg2+ | Sigma-Aldrich | D8537-500ML | |
| Penicillin-Streptomycin (5,000 U/ml) | Gibco | 15070-063 | |
| R-spondin producing cells (Cultrex HA-R-Spondin1-Fc 293T Cells) | R&D systems | 3710-001-01 | |
| TC-treated 24 well plates | Greiner-One | 662160 | |
| TC-treated black clear-bottom 96 well plates | Corning Life Sciences | 353219 | |
| TGFb type I receptor inhibitor (A83-01) | Tocris Bioscience | 2939/10 | |
| Trypsin (TrypLE Express) | Life Technologies | 12604021 | |
| WNT-3A producing cells (L-Wnt-3A cells) | MTA with J. den Hertog, Hubrecht Institute | ||
| Y-27632 dihydrochloride (Rho kinase inhibitor) | Abcam | ab120129-10 |
References
- Yen, C. L. E., Nelson, D. W., Yen, M. I. Intestinal triacylglycerol synthesis in fat absorption and systemic energy metabolism. Journal of Lipid Research. 56 (3), 489-501 (2015).
- Yen, C. L. E., Stone, S. J., Koliwad, S., Harris, C., Farese, R. V. Thematic review series: glycerolipids. DGAT enzymes and triacylglycerol biosynthesis. Journal of Lipid Research. 49 (11), 2283-2301 (2008).
- D’Aquila, T., Hung, Y. H., Carreiro, A., Buhman, K. K. Recent discoveries on absorption of dietary fat: Presence, synthesis, and metabolism of cytoplasmic lipid droplets within enterocytes. Biochimica et Biophysica Acta. 1861 (8 Pt A), 730-747 (2016).
- Chavez-Jauregui, R. N., Mattes, R. D., Parks, E. J. Dynamics of fat absorption and effect of sham feeding on postprandial lipema. Gastroenterology. 139 (5), 1538-1548 (2010).
- Chitraju, C., et al. Triglyceride Synthesis by DGAT1 Protects Adipocytes from Lipid-Induced ER Stress during Lipolysis. Cell Metabolism. 26 (2), 407-418 (2017).
- van Rijn, J. M., et al. Intestinal failure and aberrant lipid metabolism in patients with DGAT1 deficiency. Gastroenterology. 1, 130-143 (2018).
- Haas, J. T., et al. DGAT1 mutation is linked to a congenital diarrheal disorder. Journal of Clinical Investigation. 122 (12), 4680-4684 (2012).
- Gluchowski, N. L., et al. Identification and characterization of a novel DGAT1 missense mutation associated with congenital diarrhea. Journal of Lipid Research. 58 (6), 1230-1237 (2017).
- Ratchford, T. L., Kirby, A. J., Pinz, H., Patel, D. R. Congenital Diarrhea From DGAT1 Mutation Leading to Electrolyte Derangements, Protein-losing Enteropathy, and Rickets. Journal of Pediatric Gastroenterology and Nutrition. 66 (3), e82-e83 (2018).
- Stephen, J., et al. Congenital protein losing enteropathy: an inborn error of lipid metabolism due to DGAT1 mutations. European Journal of Human Genetics. 24 (9), 1268-1273 (2016).
- Schlegel, C., et al. Reversible deficits in apical transporter trafficking associated with deficiency in diacylglycerol acyltransferase. Traffic (Copenhagen, Denmark). 19 (11), 879-892 (2018).
- Wilfling, F., et al. Triacylglycerol synthesis enzymes mediate lipid droplet growth by relocalizing from the ER to lipid droplets. Developmental Cell. 24 (4), 384-399 (2013).
- Sato, T., et al. Long-term expansion of epithelial organoids from human colon, adenoma, adenocarcinoma, and Barrett’s epithelium. Gastroenterology. 141 (5), 1762-1772 (2011).
- Middendorp, S., et al. Adult stem cells in the small intestine are intrinsically programmed with their location-specific function. Stem Cells. 32 (5), 1083-1091 (2014).
- Boj, S. F., et al. Forskolin-induced Swelling in Intestinal Organoids: An In Vitro Assay for Assessing Drug Response in Cystic Fibrosis Patients. Journal of Visualized Experiments. (120), e55159 (2017).
- Schindelin, J., et al. Fiji: an open-source platform for biological-image analysis. Nature Methods. 9 (7), 676-682 (2012).
- Rueden, C. T., et al. ImageJ2: ImageJ for the next generation of scientific image data. BMC Bioinformatics. 18 (1), 529 (2017).
- Spandl, J., White, D. J., Peychl, J., Thiele, C. Live cell multicolor imaging of lipid droplets with a new dye, LD540. Traffic. 10 (11), 1579-1584 (2009).
- Hung, Y. H., Carreiro, A. L., Buhman, K. K. Dgat1 and Dgat2 regulate enterocyte triacylglycerol distribution and alter proteins associated with cytoplasmic lipid droplets in response to dietary fat. Biochimica et Biophysica Acta – Molecular and Cell Biology of Lipids. 1862 (6), 600-614 (2017).
