İnsan Bağırsak Organoidlerinde Lipid Damlacık Oluşumunun Karakterizasyonu ve Niceliği için Floresan Esaslı Bir Test
Summary
Bu protokol yağ asitleri ile stimülasyon üzerine insan bağırsak organoidlerinde lipid damlacık (LD) oluşumunun karakterizasyonu için bir test açıklar. Bu denemenin LD oluşumunun nicelleştirilmesi için nasıl kullanıldığını ve LD oluşumunu etkileyen ilaçlar için yüksek iş elde taramalarda nasıl kullanılabileceğini tartışıyoruz.
Abstract
Diyet lipidler bağırsak epitel tarafından serbest yağ asitleri (FAs) olarak alınır. Bu FA’lar hücre içi trigliserid (TG) moleküllerine dönüştürülür, lenfe veya hücre içi depolama için sitozolik lipid damlacıklarına (LD) götürülmek üzere şilomikronlara paketlenmeden önce. LDs oluşumu için önemli bir adım Diacylglycerol ayltransferazların katalitik aktivitesidir (DGAT) TG sentezinin son adımında. LDs toksik lipid türleri tampon ve farklı hücre tiplerinde hücresel metabolizmayı düzenleyen önemlidir. İnsan bağırsak epiteli düzenli lipidlerin yüksek konsantrasyonlarda ile karşı karşıya olduğundan, LD oluşumu homeostaz düzenlemek için büyük önem taşımaktadır. Burada insan bağırsak organoidlerinde en sık görülen doymamış yağ asidi, oleik asit ile uyarılması üzerine LD oluşumunun (LDF) karakterizasyonu ve nicelemesi için basit bir analiz açıklıyoruz. LDF testi, ld’lerin konfokal mikroskopi, floresan plaka okuyucu veya akış sitometrisi ile ölçülmesine olanak tanıyan LD’ye özgü floresan boya LD540’ya dayanmaktadır. LDF analizi insan bağırsak epitel hücrelerinde LD oluşumunu karakterize etmek için kullanılabilir, veya LD metabolizmasını etkileyen insan (genetik) bozuklukları incelemek için, DGAT1 eksikliği gibi. Ayrıca, bu test aynı zamanda yeni terapötik bileşikleri test etmek için yüksek iş lenme boru hattı kullanılabilir, hangi bağırsak veya organoidlerin diğer türleri LD oluşumunda kusurları geri.
Introduction
Lipidler insan diyetinin önemli bir bileşenidir ve sistemik enerji depolama ve metabolizmaönemli bir rol oynamaktadır. Sindirildiğinde, diyet lipidleri pankreas lipazları tarafından serbest yağ asitleri (FFA) ve monogliseritler (MGs) içine bozulur. Bu substratlar daha sonra bağırsak epitelinin enterositleri tarafından alınır, burada ilk olarak monogliserit ayltransferazlar (MGAT) enzimleri tarafından digliseritlere (DG) ve daha sonra diacylrigerolerol tarafından trigliserid (TG) tarafından yeniden esterlenirler. acyltransferaz 1 (DGAT1)1. Son olarak, bu TGs ya lenf sistemine veya sitosolik lipid damlacıkları (LDs) hücre içi depolama için ihracat için şilomikronlar entegre edilmiştir2,3. Şilomikronlar diğer organlara diyet lipidleri dağıtmak için gerekli olmasına rağmen, LDs hücre içi yağ depolama önemi tamamen açık değildir. Ancak, LDs bağırsakta düzenleyici bir işlev icra gösterilmiştir, onlar yavaş yavaş bir yemekten sonra dolaşıma lipidler serbest olarak 16 saat4. Ayrıca, LDs toksik yağ asidi konsantrasyonlarına karşı korumak için gösterilmiştir, lipolitik koşullar sırasında fare adipositler gibi5.
DGAT1 proteini endoplazmik retikulum (ER) membranÜzerinde yer alır ve intestinal epitelde LD oluşumunda önemli rol oynar. DGAT1’deki homozigot mutasyonlar erken başlayan şiddetli ishale ve/veya kusmaya, hipoalbuminemiye ve/veya (ölümcül) protein kaybeden enteropatiye yol açarak yağ alımı üzerine bağırsak yetmezliği ile birlikte, insan lipid homeostazisinde DGAT1’in önemini gösterir. bağırsak epitel6,7,8,9,10. İnsanlarda DGAT1 eksikliğinin ortaya çıkması nadir olduğundan, primer hasta kaynaklı hücrelere erişim az olmuştur. Ayrıca, bağırsak epitel hücrelerinin uzun vadeli kültür uzun sadece sınırlı bir uzatmak için normal fizyolojisi temsil tümör kaynaklı hücre hatları ile sınırlı olmuştur. Bu nedenle, DGAT1 aracılı LD oluşumu çoğunlukla fibroblastlar veya hayvan kaynaklı hücre hatları7,10,11,12çalışılmıştır. Bu nedenle, son zamanlarda DGAT1-eksik hasta kaynaklı fibroblastlar oleik asit ile stimülasyon sonra sağlıklı kontrol hücreleri ile karşılaştırıldığında daha az DDs birikir gösterilmiştir (OA)8.
Daha önce, protokoller üç boyutlu (3D) organoidler13şeklinde herhangi bir gastrointestinal organdan kültür epitel kök hücreleri kurulmuştur. Bu bağırsak organoidleri uzun bir süre kültürde tutulabilir13, ve hasta fonksiyonel çalışma sağlar- ve bağırsak konumuna özgü epitel özellikleri14. Onlar genetik ve fenotipik kararlı ve saklanabilir, uzun vadeli genişleme ve biyobankacılık izin13.
Yakın zamanda LD oluşumunun insan bağırsak organoidlerinde ld oluşumunda (LDF)6’dakolayca ölçülebileceğini gösterdik. 16 saat boyunca OA maruz kaldığında, organoidler lipid kaynaklı toksisite hücreleri korumak için LDs oluşturmak. OA konsantrasyonları çok yüksek olduğunda, hücreler caspase aracılı apoptoz6tarafından ölür. LDF tsay daha önce büyük ölçüde DGAT1 bağımlı olduğu gösterilmiştir organoidler DGAT1-mutant hastalardan elde edilen ve DGAT1-spesifik inhibitörleri kullanımı ile gösterildiğigibi 6.
Burada ayrıntılı olarak açıklanan LDF analizi için, 3D organoidler bağırsak biyopsilerinden kültürlenir ve kolayca yeni organoidler oluşturan tek hücrelere bozulma tarafından haftalık olarak geçmektedir. LDF analizini çalıştırmak için, ~7,500 organoid kaynaklı tek hücre 24 kuyulu bir plakanın her kuyusunda kaplanır. Organoidler birkaç gün içinde oluşur, bir gecede 1 mM OA ile kuluçkaya yatırılır ve görüntülemeyi kolaylaştıran floresan hücre geçirilmezLD spesifik boya LD540 ile boyanmıştır. LD oluşumu daha sonra konfokal mikroskopi, floresan plaka okuyucu veya akış sitometrisi ile ölçülür.
96-iyi bir biçimde bu LD oluşumu tahlil ölçekleme olarak, tahlil de insan bağırsak organoid kültürlerde LD oluşumunu etkileyen yeni ilaçlar için ekran ld oluşumunun yüksek iş lenme analizi için kullanılabilir, ya da etkileyen (insan genetik) bozuklukları çalışma LD metabolizması.
Protocol
Representative Results
Discussion
Burada, oleik asit ile kuluçka üzerine insan bağırsak organoidlerinde LD oluşumunu belirlemek için bir protokol sağlar. Bu yöntem LD’ye özgü floresan boya LD54018’edayanmaktadır, bu da organoid kültürdeki lipid damlacıklarının toplam hacminin karakterizasyonuna ve ölçülmesine olanak sağlar. İnsan bağırsak organoid kültürleri kurmak ve korumak için prosedürler13önce yayınlanmıştır , ve bu protokolün görsel bir rehber de mevcuttur<sup class="…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Biz cömertçe LD540 sağlayan için B. Spee teşekkür ederiz. Bu çalışma Hollanda Bilimsel Araştırma Örgütü (NWO-ZonMW; VIDI 016.146.353) Için S.M.
Materials
| Advanced DMEM/F12 | Gibco | 12634-028 | |
| B27 supplement | Gibco | 17504-044 | |
| Basement membrane matrix (matrigel) | BD Biosciences | 356231 | |
| DAPI | Sigma-Aldrich | D9542-1MG | |
| DGAT1 inhibitor (AZD 3988) | Tocris Bioscience | 4837/10 | |
| Fatty acid free BSA | Sigma-Aldrich | A7030 | |
| Formaldehyde | Klinipath | 4078-9001 | |
| Glutamin (GlutaMAX, 100X) | Gibco | 15630-056 | |
| HEPES (1 M) | Gibco | 15630-080 | |
| laser scanning confocal microscope | Leica | SP8X | |
| LD540 | kindly provided by Dr. B. Spee, Utrecht University | ||
| mEGF | Peprotech | 315-09_500ug | |
| N-acetyl cysteine | Sigma-Aldrich | A9165-100G | |
| Nicotinamide | Sigma-Aldrich | N0636-500G | |
| Noggin producing cells (HEK293-mNoggin-Fc cells) | MTA with J. den Hertog, Hubrecht Institute | ||
| Oleic acid | Sigma-Aldrich | O1008-5G | |
| p38 MAPK inhibitor (p38i) (SB202190) | Sigma-Aldrich | S7067-25MG | |
| PBS | Sigma-Aldrich | D8662-500ML | |
| PBS without Ca2+/Mg2+ | Sigma-Aldrich | D8537-500ML | |
| Penicillin-Streptomycin (5,000 U/ml) | Gibco | 15070-063 | |
| R-spondin producing cells (Cultrex HA-R-Spondin1-Fc 293T Cells) | R&D systems | 3710-001-01 | |
| TC-treated 24 well plates | Greiner-One | 662160 | |
| TC-treated black clear-bottom 96 well plates | Corning Life Sciences | 353219 | |
| TGFb type I receptor inhibitor (A83-01) | Tocris Bioscience | 2939/10 | |
| Trypsin (TrypLE Express) | Life Technologies | 12604021 | |
| WNT-3A producing cells (L-Wnt-3A cells) | MTA with J. den Hertog, Hubrecht Institute | ||
| Y-27632 dihydrochloride (Rho kinase inhibitor) | Abcam | ab120129-10 |
References
- Yen, C. L. E., Nelson, D. W., Yen, M. I. Intestinal triacylglycerol synthesis in fat absorption and systemic energy metabolism. Journal of Lipid Research. 56 (3), 489-501 (2015).
- Yen, C. L. E., Stone, S. J., Koliwad, S., Harris, C., Farese, R. V. Thematic review series: glycerolipids. DGAT enzymes and triacylglycerol biosynthesis. Journal of Lipid Research. 49 (11), 2283-2301 (2008).
- D’Aquila, T., Hung, Y. H., Carreiro, A., Buhman, K. K. Recent discoveries on absorption of dietary fat: Presence, synthesis, and metabolism of cytoplasmic lipid droplets within enterocytes. Biochimica et Biophysica Acta. 1861 (8 Pt A), 730-747 (2016).
- Chavez-Jauregui, R. N., Mattes, R. D., Parks, E. J. Dynamics of fat absorption and effect of sham feeding on postprandial lipema. Gastroenterology. 139 (5), 1538-1548 (2010).
- Chitraju, C., et al. Triglyceride Synthesis by DGAT1 Protects Adipocytes from Lipid-Induced ER Stress during Lipolysis. Cell Metabolism. 26 (2), 407-418 (2017).
- van Rijn, J. M., et al. Intestinal failure and aberrant lipid metabolism in patients with DGAT1 deficiency. Gastroenterology. 1, 130-143 (2018).
- Haas, J. T., et al. DGAT1 mutation is linked to a congenital diarrheal disorder. Journal of Clinical Investigation. 122 (12), 4680-4684 (2012).
- Gluchowski, N. L., et al. Identification and characterization of a novel DGAT1 missense mutation associated with congenital diarrhea. Journal of Lipid Research. 58 (6), 1230-1237 (2017).
- Ratchford, T. L., Kirby, A. J., Pinz, H., Patel, D. R. Congenital Diarrhea From DGAT1 Mutation Leading to Electrolyte Derangements, Protein-losing Enteropathy, and Rickets. Journal of Pediatric Gastroenterology and Nutrition. 66 (3), e82-e83 (2018).
- Stephen, J., et al. Congenital protein losing enteropathy: an inborn error of lipid metabolism due to DGAT1 mutations. European Journal of Human Genetics. 24 (9), 1268-1273 (2016).
- Schlegel, C., et al. Reversible deficits in apical transporter trafficking associated with deficiency in diacylglycerol acyltransferase. Traffic (Copenhagen, Denmark). 19 (11), 879-892 (2018).
- Wilfling, F., et al. Triacylglycerol synthesis enzymes mediate lipid droplet growth by relocalizing from the ER to lipid droplets. Developmental Cell. 24 (4), 384-399 (2013).
- Sato, T., et al. Long-term expansion of epithelial organoids from human colon, adenoma, adenocarcinoma, and Barrett’s epithelium. Gastroenterology. 141 (5), 1762-1772 (2011).
- Middendorp, S., et al. Adult stem cells in the small intestine are intrinsically programmed with their location-specific function. Stem Cells. 32 (5), 1083-1091 (2014).
- Boj, S. F., et al. Forskolin-induced Swelling in Intestinal Organoids: An In Vitro Assay for Assessing Drug Response in Cystic Fibrosis Patients. Journal of Visualized Experiments. (120), e55159 (2017).
- Schindelin, J., et al. Fiji: an open-source platform for biological-image analysis. Nature Methods. 9 (7), 676-682 (2012).
- Rueden, C. T., et al. ImageJ2: ImageJ for the next generation of scientific image data. BMC Bioinformatics. 18 (1), 529 (2017).
- Spandl, J., White, D. J., Peychl, J., Thiele, C. Live cell multicolor imaging of lipid droplets with a new dye, LD540. Traffic. 10 (11), 1579-1584 (2009).
- Hung, Y. H., Carreiro, A. L., Buhman, K. K. Dgat1 and Dgat2 regulate enterocyte triacylglycerol distribution and alter proteins associated with cytoplasmic lipid droplets in response to dietary fat. Biochimica et Biophysica Acta – Molecular and Cell Biology of Lipids. 1862 (6), 600-614 (2017).
