Da forpligte anaerobe organismer ikke er i stand til at vokse ved ilteksponering, er brugen af anaerobe dyrkning teknikker uundværlig. Her viser vi en enkel og effektiv metode til at dyrke en blandet kultur, der stammer fra et biogasanlæg fra medie fremstilling til gas og kvantificering af flygtige fedtsyrer.
I modsætning til aerobe organismer, strengt anaerobe mikroorganismer kræver fravær af ilt og normalt et lavt redox potentiale til at indlede vækst. Da ilt er allestedsnærværende i luft, er det udfordrende at fastholde O2-frie forhold under alle dyrknings trin, men en forudsætning for anaerob dyrkning. Den protokol, der præsenteres her, viser den vellykkede dyrkning af en anaerob blandet kultur afledt af et biogasanlæg ved hjælp af en enkel og billig metode. Der gives en præcis beskrivelse af hele anoxiske-dyrknings processen, herunder medie fremstilling, påfyldning af dyrkningskolber, tilskud med redox-indikator og reduktionsmidler til at give lave redox potentialer samt udskiftning af headspace for at holde medier fri for ilt. Desuden gives en detaljeret oversigt over aseptiske pode gas stramme serum kolber (ved hjælp af sterile sprøjter og nåle) og passende inkubations betingelser. Denne protokol omhandler yderligere gas-og væske prøvetagning med henblik på efterfølgende analyser vedrørende gassammensætning og flygtige fedtsyre koncentrationer ved anvendelse af henholdsvis gaskromatografi (GC) og højeffektiv væskekromatografi (HPLC) og beregning af biogas og metan udbytte i betragtning af den ideelle gas lov.
På jorden er Molekylær ilt i bemærkelsesværdige koncentrationer tilgængelig i områder med direkte kontakt med atmosfæren eller i tilstedeværelse af iltdannende fototroffer. Miljøer, hvor ilt er fraværende kaldes anaerob. Energiomdannelse er dog stadig mulig under anaerobe forhold via to forskellige metaboliske processer, gæring og anaerob respiration1.
Mens organismer gennemgår aerob respiration bruger ilt som en Terminal elektron acceptor, anaerob respiration kræver alternative elektron acceptorer som nitrat eller sulfat2. I det såkaldte “elektron tårn” er Redox-par organiseret efter deres redox-potentiale, og de mest negative er placeret øverst (elektron donorer) og stærkeste oxidationsmidler med positivt redox-potentiale i bunden (elektron acceptorer). Elektron overførslen mellem donorer og acceptorer fører til energibesparelse via den såkaldte åndedræts kæde, og elektroner kan fanges af elektron acceptorer-for at blive i billedet-i forskellige etager af tårnet. Derved, jo højere fald af elektroner gennem elektron tårnet, jo mere energi kan bevares ved den respektive reaktion. Derfor er respiration også muligt i anaerobe habitater, for eksempel med redox-par, herunder No3–/No2–, Fumarsyre/succininsyre, så32-/h2s, S °/h2s, MN (IV)/MN (II ), Fe (III)/FE (II)2,3. For det første, den resulterende energi bevares som membran potentiale, som efterfølgende anvendes af elektron transport fosforylering for adenosin-trifosfat (ATP) syntese af membran-bundne ATP-synthaser. I modsætning til aerob respiration kan den mængde energi, der kan bevares ved anaerob respiration, reduceres drastisk. imidlertid er energiproduktionen af de fleste anaerobe respirationer stadig højere i forhold til gæring, en anaerob energibevarings kurve i habitater, der mangler ilt og andre terminal elektron acceptorer2.
Under gæring nedbrydes energirige, organiske substrater til forskellige gæringsprodukter, der ofte definerer navnet på den samlede proces, for eksempel alkoholisk gæring. I modsætning til respirations processer er ATP-generering under fermentering begrænset til phosphorylering på substrat niveau, hvor en fosfatgruppe overføres til adenosin-di-fosfat (ADP) fra et energirigt phosphoryleret substrat2. Fermentering af mikroorganismer spiller en central rolle i den anaerobe nedbrydning af organisk materiale, da de er nøglespillere i substrat opdeling. De primære gæringsprodukter, såsom organiske syrer, alkoholer, CO2og h2, kan efterfølgende anvendes af sekundære fermenterende mikroorganismer til fremstilling af eddikesyre, co2og h2. Eksempler på gæringsprodukter omfatter mælkesyre, forskellige flygtige fedtsyrer (myre-, eddike-, propionsyre-, butyric-, valeric Acid), n-butanol, 2, 3-butandiol, acetone og ethanol.
Dyrkning af mikroorganismer under strengt anaerobe forhold kræver helt forskellige metoder og udstyr sammenlignet med dyrkning af aerobe organismer. Mens ilt-tolerante organismer ofte dyrkes på agar retter, såkaldte overflade kulturer, dette er-med et par undtagelser-næppe muligt for strengt anaerobe mikroorganismer. Derfor er berigende kulturer af strengt anaerobe mikroorganismer hovedsageligt etableret i flydende medier, der anvender kultur beholdere forseglet med gastæt septa, som sikrer en iltfri atmosfære på hovedrummet4,6, 7.
Den nuværende protokol beskrivelse vil give passende dyrkningsmetoder for målmikroorganismer fra en blandet population, der er afledt af et anaerob biogasanlæg. Isolation og dyrkning af rene kulturer er endnu mere udfordrende, men ikke en del af dette arbejde.
Her viser vi proceduren for dyrkning af et anaerob mikrobiel samfund baseret på en undersøgelse vedrørende dannelsen af phenyl syrer under anaerob nedbrydning af proteinholdige substrater8. Det mikrobielle samfund bestod af medlemmer fra alle fire faser af anaerob nedbrydning: hydrolyse, acidogenesis, acetogenesen og methanogenesis. Et mineral salt medium suppleret med en kulstofkilde, redox-indikator, vitamin og sporstof opløsning, og reduktionsmiddel blev anvendt9. Mediet blev ændret med de respektive substrater af fenylsyreprækursorer i protein8.
Det vigtigste og mest kritiske skridt i dyrkning af anaerobe mikroorganismer er at sikre iltfrie forhold i dyrkningsmedier og kolber ‘ headspace. En indikator som resazurin kan anvendes til indirekte at kontrollere den korrekte anaerobe påfyldning af kolberne. Resazurin er et almindeligt anvendt redox-farvestof, da det er billigt, giftfri og allerede effektivt i lave doser og korte inkubationstider 12. Når den er inkorporeret i medierne, gennemgår den blå farvede resazurin først et irreversibelt reduktions trin til resorufin, som er lyserød ved neutrale pH-værdier. Denne første reaktion kan opstå, når medierne er opvarmet 13. Derefter reduceres resorufin til farveløs dihydroresorufin i en reversibel sekundær reaktion (figur 7)12. Resorufin/dihydroresorufin redox-systemet bliver fuldstændigt farveløs ved et standard oxidations reduktionspotentiale på ca. Eh =-110 mv og bliver lyserød over et redox-potentiale på-51 mv 13.
For yderligere at reducere redox potentiale, for eksempel, for at lette væksten af methanogen mikroorganismer, der vides at kræve mindre end-200 mV14, en na2S opløsning kan tilsættes. Alternativt, cystein-HCl, natriumthioglycolat, eller natriumdithionit er almindeligt anvendt. Men, som reduktionsmiddel er hensigtsmæssigt at bruge, afhænger af den respektive eksperimentelle opsætning og kan kræve særlig opmærksomhed. For eksempel, natriumthioglycolat behov temperatur aktivering (f. eks, ved autoklave).
Et velafbalanceret mikrobielt konsortium bestående af forskellige Slater af bakterier og archaea og en effektivt fungerende anaerob nedbrydnings kaskade kan yderligere evalueres ved at bestemme headspace-Gassammensætningen i kultur flaskerne via gas Kromatografi. Ved håndtering af forbindelser som phenyl syrer afledt af forskellige prækursorer, vurderingen af headspace er en hurtig måde at kontrollere methanogenesis proces8. En headspace CH4 -koncentration på ca. 50-60% i kontrollerne ved slutningen af inkubationstiden indikerer en vellykket udnyttelse af de anvendte næringsstoffer og dermed en mineralisering af organisk materiale under anaerobe forhold. Den teoretiske metanproduktion og den forventede metankoncentration under fordøjelsesprocessen kan bestemmes ex ante i henhold til Buswell-Boyle ligningen efter elementær analyse af substratet eller ved at anslå indholdet af kulhydrater, proteiner og fedtstoffer i substratet. Ifølge VDI 4630 15, kulhydrater kan føre til en teoretisk biogasproduktion af 750 L kg-1 VSS (50% ch4 og 50% CO2), proteiner til 800 l kg-1 VSS (72% ch4 og 28% Co2), og fedtstoffer til 1.390 l kg -1 VSS (60% CH4 og 40% Co2).
Desuden blev dannelse og eventuel efterfølgende nedbrydning af VFAs og phenyl syrer overvåget. Nedbrydningsprocessen kan evalueres ved at analysere VFA-koncentrationerne (f. eks. acetat, propionat) på forskellige tidspunkter. Ophobning af kortkædede fedtsyrer som acetat og/eller propionat kan pege på forstyrrelser i methanogen Fællesskabet sammensætning og til en samlet reaktor overbelastning. Men en velafbalanceret mikrobiel nedbrydning kaskade kan endda klare meget høje VFA og acetat koncentrationer9. Desuden kan acetat/propionat forholdet yderligere give oplysninger om den samlede reaktor tilstand16. Der er dog mange parametre, som egner sig til procesovervågning, og som skal udvælges i henhold til de foreslåede eksperimentelle hypoteser. I det foreliggende eksempel var målvariablerne phenylsyrekoncentrationer (figur 6).
The authors have nothing to disclose.
Denne forskning blev finansieret af den østrigske videnskabs fond (FWF): projektnummer P 29360 og P 29143. Publikationen blev støttet af Publikationsfonds der Universität Innsbruck. Vi anerkender i høj grad EIG.
culture flasks (120 mL, N20) | Ochs, Germany | 102046 | |
buty rubber septa (N20) | Ochs, Germany | 102049 | |
aluminium caps (N20) | Ochs, Germany | 102050 | |
N2 gas | Messer, Austria | purity 5.0 | |
syringes + cannulae | various | ||
crimper | Ochs, Germany | 102051 | |
de-crimper | Ochs, Germany | 102052 | |
GC2010 | Shimadzu | ||
Shin-carbon GC column | Restek | chromatographic separation of H2, O2, CH4, and CO2 | |
HPLC Prominence | Shimadzu | ||
Fast Fruit HPLC Column | Phenomenex | chromatographic separation of VFAs, phenyl acids, etc. |