के रूप में अवायवीय जीव ऑक्सीजन जोखिम पर विकसित करने में असमर्थ हैं, अवायवीय culturing तकनीकों का उपयोग अपरिहार्य है. यहाँ, हम एक मिश्रित एक बायोगैस संयंत्र से गैस और अस्थिर फैटी एसिड परिमाणीकरण के लिए तैयार करने के लिए एक बायोगैस संयंत्र से व्युत्पन्न संस्कृति खेती करने के लिए एक सरल और प्रभावी विधि का प्रदर्शन.
एरोबिक जीवों के विपरीत, सख्ती से अवायवीय सूक्ष्मजीवों ऑक्सीजन की अनुपस्थिति की आवश्यकता होती है और आमतौर पर विकास आरंभ करने के लिए एक कम redox क्षमता. के रूप में ऑक्सीजन हवा में सर्वव्यापी है, खेती के सभी चरणों के दौरान ओ2मुक्त शर्तों को बनाए रखना चुनौतीपूर्ण है, लेकिन अवायवीय खेती के लिए एक शर्त है. यहाँ प्रस्तुत प्रोटोकॉल एक अवायवीय मिश्रित एक बायोगैस संयंत्र से प्राप्त संस्कृति के सफल खेती को दर्शाता है एक सरल और सस्ती विधि का उपयोग कर. पूरे anoxic culturing प्रक्रिया का एक सटीक विवरण मीडिया की तैयारी सहित दिया जाता है, खेती फ्लास्क भरने, redox सूचक के साथ पूरकता और एजेंटों को कम करने के लिए कम redox क्षमता प्रदान करने के साथ ही headspace का आदान प्रदान रखने के लिए मीडिया ऑक्सीजन से मुक्त. इसके अलावा, asptically inoculating गैस तंग सीरम फ्लास्क का एक विस्तृत अवलोकन (बंध्य सिरिंजों और सुइयों का उपयोग करके) और उपयुक्त ऊष्मायन स्थितियों प्रदान की जाती है। वर्तमान प्रोटोकॉल गैस संरचना और अस्थिर फैटी एसिड सांद्रता गैस क्रोमैटोग्राफी (जीसी) और उच्च प्रदर्शन तरल क्रोमैटोग्राफी (HPLC) का उपयोग कर के बारे में बाद के विश्लेषण के लिए गैस और तरल नमूने के साथ आगे सौदों, और बायोगैस और मीथेन की गणना आदर्श गैस कानून पर विचार.
उल्लेखनीय सांद्रता में पृथ्वी आणविक ऑक्सीजन पर वातावरण के साथ सीधे संपर्क वाले क्षेत्रों में या ऑक्सीजनी प्रकाशपोषी की उपस्थिति में उपलब्ध है। वातावरण जिसमें ऑक्सीजन अनुपस्थित है अवायवीय कहा जाता है. तथापि, ऊर्जा रूपांतरण अभी भी दो अलग चयापचय प्रक्रियाओं, किण्वन और अवायवीय श्वसन1के माध्यम से अवायवीय परिस्थितियों में संभव है।
जबकि एरोबिक श्वसन से गुजरने वाले जीव अंतक इलेक्ट्रॉन स्वीकारकर्ता के रूप में ऑक्सीजन का उपयोग कर रहे हैं, अवायवीय श्वसन के लिए नाइट्रेट या सल्फेट2जैसे वैकल्पिक इलेक्ट्रॉन स्वीकारकर्ताओं की आवश्यकता होती है। तथाकथित “इलेक्ट्रोन टॉवर” में, रेडॉक्स जोड़ों को उनकी रेडॉक्स क्षमता के अनुसार आयोजित किया जाता है, शीर्ष पर स्थित सबसे नकारात्मक वाले (इलेक्ट्रोन दाताओं) और सबसे मजबूत ऑक्सीकरण एजेंटों के साथ नीचे सकारात्मक रेडॉक्स क्षमता के साथ (इलेक्ट्रोन स्वीकारकर्ता)। दाताओं और स्वीकारकर्ताओं के बीच इलेक्ट्रॉन हस्तांतरण तथाकथित श्वसन श्रृंखला और इलेक्ट्रॉनों के माध्यम से ऊर्जा संरक्षण की ओर जाता है इलेक्ट्रॉन स्वीकारकर्ताओं द्वारा कब्जा कर लिया जा सकता है – चित्र में रहने के लिए – टॉवर के विभिन्न फर्श में. इस प्रकार इलेक्ट्रॉन ों के माध्यम से इलेक्ट्रॉनों की गिरावट जितनी अधिक होगी, संबंधित अभिक्रिया द्वारा अधिक ऊर्जा संरक्षित की जा सकती है। इसलिए, श्वसन अवायवीय आवासों में भी संभव है, उदाहरण के लिए, कोई3–/सं2– , फ्यूमेरिक एसिड/सुचिनिक अम्ल, SO32-/H2S, S]/H2S, Mn(IV)/Mn(II सहित रेडॉक्स जोड़े के साथ) ), फे(III)/Fe(II)2,3. सबसे पहले, परिणामस्वरूप ऊर्जा झिल्ली क्षमता है, जो बाद में झिल्ली से बाध्य एटीपी-सिन्थेसास द्वारा एडेनोसाइन-ट्राइफॉस्फेट (एटीपी) संश्लेषण के लिए इलेक्ट्रॉन परिवहन फॉस्फोरिलेशन द्वारा प्रयोग किया जाता है के रूप में संरक्षित है। एरोबिक श्वसन के विपरीत, ऊर्जा की मात्रा है कि अवायवीय श्वसन द्वारा संरक्षित किया जा सकता है नाटकीय रूप से कम किया जा सकता है; तथापि, अधिकांश अवायवीय श्वसनों का ऊर्जा निर्गत किण्वन की तुलना में अभी भी अधिक है, ऑक्सीजन तथा अन्य टर्मिनल इलेक्ट्रॉन स्वीकारकर्ताओं2की कमी वाले आवासों में अवायवीय ऊर्जा संरक्षण पथ।
किण्वन के दौरान, ऊर्जा समृद्ध, कार्बनिक substrates विभिन्न किण्वन उत्पादों है कि अक्सर समग्र प्रक्रिया के नाम को परिभाषित करने के लिए अपमानित कर रहे हैं, उदाहरण के लिए, शराबी किण्वन. श्वसन प्रक्रियाओं के विपरीत, किण्वन के दौरान एटीपी उत्पादन सब्सट्रेट स्तर फॉस्फोरिलेशन तक सीमित है जिसके दौरान एक फॉस्फेट समूह को ऊर्जा से भरपूर फॉस्फोरीलेट2से एडेनोसाइन-डी-फॉस्फेट (एडीपी) में स्थानांतरित किया जाता है। निषेचन सूक्ष्मजीवों कार्बनिक पदार्थ के अवायवीय गिरावट में एक केंद्रीय भूमिका निभाते हैं क्योंकि वे सब्सट्रेट टूटने में प्रमुख खिलाड़ी हैं। प्राथमिक किण्वन उत्पाद, जैसे कार्बनिक अम्ल , अल्कोहल , ब्व्2और एच2, बाद में एसिटिक एसिड, ब्व्2और एच2का उत्पादन करने के लिए द्वितीयक किण्वित सूक्ष्मजीवों द्वारा उपयोग किया जा सकता है। किण्वन उत्पादों के लिए उदाहरण लैक्टिक एसिड, विभिन्न अस्थिर फैटी एसिड (फॉर्मिक-, एसिटिक-, प्रोपिओनिक-, ब्यूटिक-, वैलेरिक एसिड), n-butanol, 2,3-butandiol, एसीटोन, और इथेनॉल शामिल हैं।
सख्ती से अवायवीय परिस्थितियों में सूक्ष्मजीवों की खेती एरोबिक जीवों की खेती के साथ तुलना में पूरी तरह से अलग तरीकों और उपकरणों की आवश्यकता है। जबकि ऑक्सीजन-सहिष्णु जीवों को अक्सर आगर व्यंजन, तथाकथित सतह संस्कृतियों पर खेती की जाती है, यह है – कुछ अपवादों के साथ – सख्ती से अवायवीय सूक्ष्मजीवों के लिए शायद ही संभव हो। इसलिए, कड़ाई से अवायवीय सूक्ष्मजीवों की संवर्धन संस्कृतियों को मुख्य रूप से तरल मीडिया में स्थापित किया जाता है जो गैस-टाइट सेप्टा के साथ सील किए गए संस्कृति जहाजों को लागू करता है जो ऑक्सीजन मुक्त हेडस्पेस वातावरण4,6, 7.
वर्तमान प्रोटोकॉल विवरण एक अवायवीय बायोगैस संयंत्र से व्युत्पन्न मिश्रित आबादी के लक्ष्य सूक्ष्मजीवों के लिए उपयुक्त खेती के तरीके प्रदान करेगा। अलगाव और शुद्ध संस्कृतियों की खेती और भी अधिक चुनौतीपूर्ण है, लेकिन इस काम का हिस्सा नहीं है.
यहाँ हम प्रोटीनकेश substrates के अवायवीय पाचन के दौरान फेनिल एसिड के गठन के बारेमें एक अध्ययन के आधार पर एक अवायवीय माइक्रोबियल समुदाय की खेती के लिए प्रक्रिया दिखाते हैं। माइक्रोबियल समुदाय में अवायवीय पाचन के सभी चार चरणों के सदस्य शामिल थे: हाइड्रोलिसिस, अम्लजनन, एसीटोजेनेसिस, और मेथेनोजेनेसिस। एक खनिज नमक मध्यम एक कार्बन स्रोत के साथ पूरक, redox सूचक, विटामिन और ट्रेस तत्व समाधान, और एजेंट को कम करने के लिए लागू किया गया था9. इस माध्यम को संबंधित प्रोटीनी फेनिल अम्ल पुरोगामी के साथ संशोधित किया गया था.
अवायवीय सूक्ष्मजीवों की खेती में सबसे महत्वपूर्ण और महत्वपूर्ण कदम खेती मीडिया और फ्लास्क के हेडस्पेस में ऑक्सीजन मुक्त स्थिति सुनिश्चित करना है। रेसाजुरिन जैसे संकेतक का उपयोग अप्रत्यक्ष रूप से फ्लास्क के सही अवायवीय भरने की जांच करने के लिए किया जा सकता है। Resazurin एक आमतौर पर इस्तेमाल किया redox डाई के रूप में यह सस्ती है, गैर विषैले, और पहले से ही कम खुराक और कम ऊष्मायन समय में प्रभावी 12. जब मीडिया के लिए शामिल, नीले रंग resazurin पहले resorufin, जो तटस्थ पीएच मूल्यों पर गुलाबी है करने के लिए एक अपरिवर्तनीय कमी कदम से होकर गुजरती है. यह पहली प्रतिक्रिया तब हो सकती है जब मीडिया को 13गर्म किया जाता है . इसके बाद, रेसोरूफिन को उत्क्रमणीय द्वितीयक अभिक्रिया में बेरंग डाइहाइड्रोरेसोरूफिन में कम कर दिया जाता है (चित्र 7)12. Resorufin/dihydroresorufin redox प्रणाली के बारे में ईएच के एक मानक ऑक्सीकरण कमी क्षमता पर पूरी तरह से बेरंग हो जाता है – -110 mV और -51 mV 13की एक redox क्षमता के ऊपर गुलाबी बदल जाता है.
रेडॉक्स क्षमता को और कम करने के लिए, उदाहरण के लिए, मेथेनोजेनिक सूक्ष्मजीवों के विकास को सुविधाजनक बनाने के लिए, जिसे -200 एमवी14से कम की आवश्यकता होती है, एक ना2एस समाधान जोड़ा जा सकता है। वैकल्पिक रूप से, सिस्टीन-एचसीएल, सोडियम-थायोग्लाइकोलेट, या सोडियम डाइथियोनाइट आमतौर पर उपयोग किया जाता है। हालांकि, जो एजेंट को कम करने का उपयोग करने के लिए उपयुक्त है संबंधित प्रयोगात्मक सेटअप पर निर्भर करता है और विशेष ध्यान देने की आवश्यकता हो सकती है. उदाहरण के लिए, सोडियम थायोग्लाइकोलेट को तापमान सक्रियण की आवश्यकता होती है (उदाहरण के लिए, ऑटोक्लेवन द्वारा)।
एक अच्छी तरह से संतुलित माइक्रोबियल संघ, बैक्टीरिया और Archaea के विभिन्न वंश के शामिल है, और एक कुशलता से काम अवायवीय गिरावट झरना आगे गैस के माध्यम से संस्कृति फ्लास्क में headspace गैस संरचना का निर्धारण करके मूल्यांकन किया जा सकता है क्रोमैटोग्राफी. जब विभिन्न अग्रदूतों से व्युत्पन्न फ़ेनिल एसिड जैसे यौगिकों को संभालते हैं, तो हेडस्पेस का मूल्यांकन मेथेनोजेनेसिस प्रक्रिया8की जांच करने का एक तेज़ तरीका है। ऊष्मायन अवधि के अंत में नियंत्रण में लगभग 50-60% की एक हेडस्पेस CH4 एकाग्रता लागू पोषक तत्वों का सफल उपयोग इंगित करती है और इस प्रकार अवायवीय परिस्थितियों में कार्बनिक सामग्री का एक खनिज। पाचन प्रक्रिया के दौरान सैद्धांतिक मीथेन उत्पादन और उम्मीद मीथेन सांद्रता सब्सट्रेट के प्राथमिक विश्लेषण के बाद या की सामग्री का आकलन करके Buswell-Boyle समीकरण के अनुसार पूर्व निर्धारित किया जा सकता है कार्बोहाइड्रेट, प्रोटीन, और सब्सट्रेट में वसा. VDI 4630 15के अनुसार , कार्बोहाइड्रेट 750 एल किलो-1 वीएसएस (50% CH4 और 50% सीओ2), प्रोटीन से 800 एल किलो-1 वीएसएस (72% CH4 और 28 % CO2) और वसा का सैद्धांतिक बायोगैस उत्पादन हो सकता है 1,390 एल किलो -1 वीएसएस (60% CH4 और 40% सीओ2)।
इसके अलावा, VFAs और फ़ेनिल एसिड के गठन और संभव बाद में गिरावट की निगरानी की गई. गिरावट की प्रक्रिया VFA सांद्रता का विश्लेषण करके मूल्यांकन किया जा सकता है (उदा., एसीटेट, propionate) अलग अलग समय बिंदुओं पर. एसीटेट और/या प्रोपिओनेट जैसे शॉर्ट-चेन फैटी एसिड का संचय मेथेनोजेनिक समुदाय संरचना में गड़बड़ी को इंगित कर सकता है और एक समग्र रिएक्टर अधिभार के लिए। हालांकि, एक अच्छी तरह से संतुलित माइक्रोबियल गिरावट झरना भी बहुत उच्च VFA और एसीटेट सांद्रता9के साथ सामना कर सकते हैं. इसके अलावा, ऐसीटेट / प्रोपिओनेट अनुपात समग्र रिएक्टर स्थिति16के बारे में जानकारी प्रदान कर सकता है। हालांकि, वहाँ कई प्रक्रिया की निगरानी है कि प्रस्तावित प्रयोगात्मक hypotheses के अनुसार चयन किया जाना है के लिए उपयुक्त पैरामीटर हैं. वर्तमान उदाहरण में लक्ष्य चर फ़ेनिल अम्ल सांद्रता थे (चित्र 6)।
The authors have nothing to disclose.
इस शोध ऑस्ट्रियाई विज्ञान कोष (FWF): परियोजना संख्या P 29360 और पी 29143 द्वारा वित्त पोषित किया गया. प्रकाशन Publikationsfonds der Universit]t Innsbruck द्वारा समर्थित किया गया था. हम बहुत EIG स्वीकार करते हैं.
culture flasks (120 mL, N20) | Ochs, Germany | 102046 | |
buty rubber septa (N20) | Ochs, Germany | 102049 | |
aluminium caps (N20) | Ochs, Germany | 102050 | |
N2 gas | Messer, Austria | purity 5.0 | |
syringes + cannulae | various | ||
crimper | Ochs, Germany | 102051 | |
de-crimper | Ochs, Germany | 102052 | |
GC2010 | Shimadzu | ||
Shin-carbon GC column | Restek | chromatographic separation of H2, O2, CH4, and CO2 | |
HPLC Prominence | Shimadzu | ||
Fast Fruit HPLC Column | Phenomenex | chromatographic separation of VFAs, phenyl acids, etc. |