Som forplikte anaerobe organismer er ute av stand til å vokse på oksygen eksponering, bruk av anaerob dyrking teknikker er uunnværlig. Her viser vi en enkel og effektiv metode for å dyrke en blandet kultur avledet fra et biogass-anlegg fra Media forberedelse til gass og flyktige fatty acid kvantifisering.
I motsetning til aerobe organismer, strengt anaerobe mikroorganismer krever fravær av oksygen og vanligvis en lav Redox potensial til å initiere vekst. Som oksygen er allestedsnærværende i luft, beholde O2-frie forhold under alle trinn av dyrking er utfordrende, men en forutsetning for anaerob dyrking. Protokollen som presenteres her demonstrerer vellykket dyrking av en anaerob blandet kultur avledet fra en biogass anlegg ved hjelp av en enkel og rimelig metode. En presis beskrivelse av hele anoksisk dyrking prosessen er gitt inkludert Media forberedelse, fylling av dyrking flasker, tilskudd med Redox indikator og redusere agenter for å gi lave Redox potensialer samt utveksle Headspace å holde medier uten oksygen. Videre er det gitt en detaljert oversikt over aseptisk vaksinere gasstette serum flasker (ved bruk av sterile sprøyter og nåler) og egnede inkubasjons forhold. Den nåværende protokollen omhandler videre gass og væske prøvetaking for senere analyser vedrørende gass sammensetning og flyktige fettsyrer konsentrasjoner ved hjelp av gass kromatografi (GC) og høy ytelse flytende kromatografi (HPLC), henholdsvis, og beregning av biogass og metan yield vurderer den ideelle gass loven.
På jorden er molekylær oksygen i bemerkelsesverdige konsentrasjoner tilgjengelig i områder som har direkte kontakt med atmosfæren eller i nærvær av oxygenic phototrophs. Miljøer der oksygen er fraværende kalles anaerob. Imidlertid er energi konvertering fortsatt mulig under anaerobe forhold via to forskjellige metabolske prosesser, gjæring og anaerob åndedrett1.
Mens organismer som gjennomgår aerob åndedrett bruker oksygen som Terminal elektron Acceptor, krever anaerob åndedrett alternative elektron aksept Orer som nitrat eller sulfat2. I den såkalte “elektron tårn”, er Redox par organisert i henhold til deres Redox potensial, med de mest negative som ligger på toppen (elektron givere) og sterkeste oksidasjonsmidler med positiv Redox potensial på bunnen (elektron aksept Orer). Elektron overføringen mellom donorer og aksept Orer fører til energisparing via den såkalte luftveis kjeden og elektroner kan fanges opp av elektron aksept Orer-å bo i bildet-i forskjellige etasjer i tårnet. Derved, jo høyere fall av elektroner gjennom elektron tårnet, jo mer energi kan bli bevart av de respektive reaksjon. Derfor er åndedrett også mulig i anaerobe habitater, for eksempel med Redox par, inkludert ingen3–/no2–, fumar acid/ravsyre acid, så32-/H2S, s °/H2s, MN (IV)/MN (II ), Fe (III)/fe (II)2,3. Først blir den resulterende energien bevart som membran potensial, som senere brukes av elektron transport fosforylering for adenosin-trifosfat (ATP) syntese av membran-bundet ATP-synthases. I motsetning til aerob åndedrett, kan mengden energi som kan bevares ved anaerob åndedrett reduseres dramatisk; Imidlertid er energiproduksjonen av de fleste anaerobe respirations fortsatt høyere sammenlignet med gjæring, en anaerob energisparing bane i habitater som mangler oksygen og andre Terminal elektron aksept Orer2.
Under gjæring, energi-rik, organiske underlag er degradert til ulike gjærings produkter som ofte definerer navnet på den samlede prosessen, for eksempel alkoholholdige gjæring. I motsetning til åndedrett prosesser, ATP generasjon under gjæring er begrenset til substrat-nivå fosforylering der en fosfat gruppe er overført til adenosin-di-fosfat (ADP) fra en energi-rik fosforylert substrat2. Gjæring mikroorganismer spiller en sentral rolle i anaerob degradering av organisk materiale som de er viktige-aktører i substrat sammenbrudd. De primære gjærings produktene, som organiske syrer, alkoholer, CO2og H2, kan senere brukes av sekundære gjærings mikroorganismer for å produsere eddiksyre, co2og H2. Eksempler for gjæring produkter inkluderer melkesyre, ulike flyktige fettsyrer (maursyre-, eddiks-, propionsyre-, smørsyre-, valeriansyre acid), n-butanol, 2, 3-butandiol, aceton, og etanol.
Dyrking av mikroorganismer under strengt anaerobe forhold krever helt forskjellige metoder og utstyr sammenlignet med dyrking av aerobe organismer. Mens oksygen-tolerante organismer er ofte dyrket på agar retter, såkalt overflate kulturer, er dette-med noen få unntak-neppe mulig for strengt anaerobe mikroorganismer. Derfor, berikelse kulturer av strengt anaerobe mikroorganismer er i hovedsak etablert i flytende Media søker kultur fartøy forseglet med gasstette septa som sikrer en oksygenfri Headspace atmosfære4,6, 7i.
Den nåværende protokollen beskrivelse vil gi hensiktsmessig dyrking metoder for mål mikroorganismer av en blandet befolkning avledet fra en anaerob biogass anlegget. Isolasjon og dyrking av rene kulturer er enda mer utfordrende, men ikke en del av dette arbeidet.
Her viser vi prosedyren for dyrking av en anaerob mikrobiell samfunn basert på en studie om dannelsen av fenyl syrer under anaerob fordøyelse av proteinaktige underlag8. Den mikrobielle samfunnet besto av medlemmer fra alle fire faser av anaerob fordøyelse: hydrolyse, acidogenesis, acetogenesis, og methanogenesis. En mineral salt medium supplert med en karbon kilde, Redox-indikator, vitamin og sporstoffet løsning, og redusere agent ble brukt9. Mediet ble endret med de respektive proteinaktige fenyl acid forløper underlag8.
Det viktigste og mest kritiske trinnet i dyrking anaerobe mikroorganismer er å sikre oksygen-frie forhold i dyrking av medier og kanner ‘ Headspace. En indikator som resazurin kan brukes til å indirekte kontrollere riktig anaerob fylling av flaskene. Resazurin er en vanlig brukt Redox fargestoff som det er billig, ikke-giftig, og allerede effektiv i lave doser og korte inkubasjons ganger 12. Når innlemmet å Media, det blåfarge farget resazurin for det første gjennomgår en irreversibel reduksjon steg å resorufin, hvilke er lyserød for nøytral pH verdier. Denne første reaksjonen kan oppstå når mediene varmes opp 13. Deretter blir resorufin redusert til fargeløs dihydroresorufin i en reversibel sekundær reaksjon (figur 7)12. Den resorufin/dihydroresorufin Redox systemet blir helt fargeløs på en standard oksidasjons-reduksjon potensialet for om Eh =-110 mv og svinger rosa over et Redox potensial av-51 mv 13.
For å ytterligere redusere Redox potensialet, for eksempel for å lette veksten av methanogenic mikroorganismer som er kjent for å kreve mindre enn-200 mV14, kan en na2S-løsning legges til. Alternativt brukes cystein-HCl, natrium-tioglykolat eller natrium dithionite ofte. Men, som reduserer agent er hensiktsmessig å bruke, avhenger av de respektive eksperimentelle oppsett og kan kreve spesiell oppmerksomhet. For eksempel trenger natrium tioglykolat temperatur aktivering (f.eks. ved autoklavering).
En godt balansert mikrobiell konsortium, bestående av ulike slekter av bakterier og Archaea, og en effektivt arbeider anaerob fornedrelse Cascade kan videre evalueres ved å bestemme den Headspace gass sammensetningen i kulturen flasker via gass kromatografi. Ved håndtering av forbindelser som fenyl syrer avledet fra ulike forløpere, er vurderingen av Headspace en rask måte å sjekke methanogenesis prosessen8. En Headspace CH4 konsentrasjon på ca. 50-60% i kontrollene på slutten av inkubasjonsperioden indikerer en vellykket utnyttelse av anvendt næringsstoffer og dermed en mineralisering av organisk materiale under anaerobe forhold. Den teoretiske metan produksjon og man metan konsentrasjoner under fordøyelsen prosessen kan bestemmes ex ante ifølge Buswell-Boyle ligningen etter elementær analyse av underlaget eller ved å estimere innholdet i karbohydrater, proteiner, og fett i underlaget. Ifølge VDI 4630 15, kan karbohydrater føre til en teoretisk biogass-produksjon på 750 L kg-1 VSS (50% ch4 og 50% CO2), proteiner til 800 l kg-1 VSS (72% ch4 og 28% co2), og fett til 1 390 l kg -1 VSS (60%4 CH og 40% co2).
Videre ble dannelse og eventuell påfølgende degradering av VFAs og fenyl syrer overvåket. Nedbrytning prosessen kan evalueres ved å analysere VFA konsentrasjoner (f. eks acetate, propionate) på ulike tidspunkt poeng. Akkumulering av Short-kjeden fettsyrer som acetate og/eller propionate kan peke på forstyrrelser i methanogenic samfunnet sammensetning og til en samlet reaktor overbelastning. Men, en godt balansert mikrobiell degradering kaskade kan selv takle svært høy VFA og acetate konsentrasjoner9. Dessuten kan acetate/propionate forholdet ytterligere gi informasjon om den samlede reaktoren tilstand16. Det er imidlertid mange parametre egnet for Prosessovervåking som må velges i henhold til den foreslåtte eksperimentelle hypoteser. I dagens eksempel var mål variablene fenyl yre konsentrasjoner (figur 6).
The authors have nothing to disclose.
Denne forskningen ble finansiert av Austrian Science Fund (FWF): prosjektnumre P 29360 og P 29143. Publisering ble støttet av Publikationsfonds der Universität Innsbruck. Vi erkjenner sterkt EIG.
culture flasks (120 mL, N20) | Ochs, Germany | 102046 | |
buty rubber septa (N20) | Ochs, Germany | 102049 | |
aluminium caps (N20) | Ochs, Germany | 102050 | |
N2 gas | Messer, Austria | purity 5.0 | |
syringes + cannulae | various | ||
crimper | Ochs, Germany | 102051 | |
de-crimper | Ochs, Germany | 102052 | |
GC2010 | Shimadzu | ||
Shin-carbon GC column | Restek | chromatographic separation of H2, O2, CH4, and CO2 | |
HPLC Prominence | Shimadzu | ||
Fast Fruit HPLC Column | Phenomenex | chromatographic separation of VFAs, phenyl acids, etc. |