Innkapslet celleteknologi for levering av biologer til museøyet

Summary

Presentert her er en protokoll for bruk av alginat som polymer i mikroenkapsling av udødelige celler for langsiktig levering av biologer til gnagerøyne.

Abstract

Mange nåværende terapeutiske midler under utvikling for sykdommer i den bakre stangen i øyet er biologer. Disse stoffene må administreres ofte, vanligvis via intravitreale injeksjoner. Innkapslede celler som uttrykker den biologiske av valget blir et verktøy for lokal proteinproduksjon og frigjøring (f.eks. via langsiktig legemiddellevering). I tillegg benytter innkapslingssystemer permeable materialer som tillater diffusjon av næringsstoffer, avfall og terapeutiske faktorer inn og ut av celler. Dette skjer mens du maskerer cellene fra vertens immunrespons, og unngår behovet for undertrykkelse av vertsimmunsystemet. Denne protokollen beskriver bruken av alginat som polymer i mikroenkapsling kombinert med elektrospraymetoden som mikroenkapslingsteknikk. ARPE-19 celler, en spontant oppstår menneskelig RPE cellelinje, har blitt brukt i langsiktige celleterapi eksperimenter på grunn av sin levetid funksjonalitet, og det brukes her for innkapsling og levering av kapslene til musen øyne. Manuskriptet oppsummerer trinnene for cellemikroenkapsling, kvalitetskontroll og okulær levering.

Introduction

Cellebaserte terapier representerer revolusjonerende biologiske teknikker som har blitt brukt mye i medisin. Nylig har de blitt brukt med hell i behandlingen av nevrodegenerative sykdommer, øyesykdommer og kreft. Celleterapi dekker et bredt spekter av felt fra celleerstatning til legemiddellevering, og denne protokollen fokuserer på sistnevnte. Biologisk nedbrytbare alginatmikrokapsler (MC) har vist effektivitet som leveringssystem, og de blir mye brukt i biomedisinsk felt. Alginat har blitt brukt i mikroenkapsling på grunn av sin enkle gelling prosess, biologisk nedbrytbarhet, utmerket biokompatibilitet, og stabilitet under in vivo forhold^1,2,3,4.

Elektrospraymetoden, som mikroenkapslingsteknikk, har blitt brukt til å innkapsle peptider og proteiner ved hjelp av alginat (base polymer) og poly-l-ornithin (sekundær belegg polymer). Begge polymerer er naturlig funnet og brukes til deres biokompatibilitet^5,6,7. Men den største utfordringen i cellebasert terapi er undertrykkelse av vertsimmunsystemet for å unngå bivirkninger forårsaket av immunsuppressive legemidler. Permeabiliteten av alginatmikrokapsler regnes som en egnet egenskap for celleinnkapsling, noe som gjør det mulig å spre næringsstoffer, avfall og terapeutiske faktorer inn og ut av celler mens du maskerer dem fra vertenimmunrespons^8,9,10.

I øyet har innkapslede celler blitt brukt i kliniske studier for konstant levering av biologer (dvs. vekstfaktorer^11,,12 og vekstfaktorantagonister¹³) for behandling av retinitt pigmentosa eller aldersrelatert makuladegenerasjon. Andre mål som komplementhemmere¹⁴ blir også undersøkt i prekliniske omgivelser.

Protocol

Alle eksperimenter ble utført i samsvar med ARVO Statement for bruk av dyr i oftalmisk og visjonsforskning og ble godkjent av Medical University of South Carolina Animal Care and Use Committee under protokoll-ID 00399. 1. Cellekultur Generer humane retinal pigment epitelceller (ARPE-19) cellelinje som stabilt uttrykker genet av valget i henhold til publiserte protokoller14,15. Vedlikehold celler i Dulbecco’s Modifi…

Representative Results

ARPE-19 celler er en spontant udødeliggjort menneskelig RPE cellelinje som har vist seg å være egnet til innkapsling og langsiktig overlevelse ved implantasjon av kapsler i øyet. Verktøyene for alginatinnkapsling er vist i figur 1. I denne studien ble det vist at ved innkapsling i alginat ble cellene i alginatkapsler bekreftet av lysfeltavbildning (figur 2A). Levende døde analyser ble utført på cellene inne i kapslene, og viste 90 % levedyktighet etter i…

Discussion

Denne celleinnkapslingsteknikken er relativt rask og enkel å utføre; Visse punkter må imidlertid huskepå for å oppnå nøyaktige nedstrømsresultater. Celler bør opprettholdes i kultur i en Petri-skål før innkapsling og holdes på riktig samløp. Innkapsling bør utføres i en riktig ventilasjonshette med regulert luftstrøm, om mulig. For sterk av en luftstrøm kan påvirke kapseldannelse, spesielt i langsiktige eksperimenter. Sterile redskaper og løsninger er avgjørende for langsiktig vedlikehold av celler i …

Materials

3 mL Syringe	BD	309656
30 G 1" Blunt needle	SAI Infusion technology	B30-100
Alginic acid sodium salt, from brown algae	Sigma	A0682
Atropine Sulfate Ophthalmolic solution (1%)	Akorn	NDC 17478-215-15	for pupil dilation
BD 1 mL Syringe 26 G x 3/8 (0.45 mm x 10 mm)	Becton, Dickinson and Company	DG518105 500029609 REF 309625	to generate the guide hole
Calcium chloride, Anhydrous, granular	Sigma	C1016
GenTeal Tears	Alcon	NDC 0078-0429-47	to lubricate the eyes during anesthesia
Goniotaire: Hypromellose (2.5%) Ophthalmolic Demulcent Solution (Sterile)	Altaire Pharmaceuticals Inc.	NDC 59390-182-13	to lubricate the eyes during anesthesia
Hamilton Needle/syringe Tip: 27 Gauge, Small Hub RN NDL, custum length (12mm), point style 3, 6/PK	Hamilton	7803-01	for intravitreal delivery of capsules
Hamilton Syringe: 2.5 µL, Model 62 RN SYR, NDL Sold Separately	Hamilton	7632-01	for intravitreal delivery of capsules
HEPES buffer, 1M	Fisher Bioreagents	BP299100
High voltage generator	ESD EMC Technology	ES813-D20
LIVE/DEAD Viability/Cytotoxicity Kit	Thermofisher Scientific	L3224
L-Ornithine hydrochloride, 99%	Alfa Aesar	A12111
Neomycin and Polymyxin B Sulfates and Dexamethasone Ophthalmolic Ointment	SANDOZ	NDC 61314-631-36	antibiotic to prevent infection after intravitreal injection
Phenolephrine Hydrochloride Ophthalmolic Solution (2.5%)	Akorn	NDC 17478-201-15	for pupil dilation
Sodium Chloride	Sigma	S-5886
Sterile syringe filters, 0.2 um	VWR	28143-312
Syringe pump	GRASEBY	MS16A