מודל של הקרנית של הקרניות הפותל באמצעות לחצני הקרנית מפוצלת
Summary
כאן, פרוטוקול צעד אחר צעד להכנה וטיפוח של כפתורי הקרנית מפוצל חזירי מוצג. כמו זה אורגאנו-מעובד בדרך כלל מודל תרבות האיברים מראה שיעורי מוות של תאים בתוך 15 ימים, המקבילה לקרנית התורם האנושי, הוא מייצג את המודל הראשון המאפשר טיפוח לטווח ארוך של קרניות לא אנושיות מבלי להוסיף דקטרן רעיל.
Abstract
המחקרים הניסיוניים על תאי הקרנית. משויכים למספר קשיים קרניות של תורמים אנושיים נדירות ולעיתים רחוקות זמינות לחקירות נסיוניות כאשר הן נחוצות בדרך כלל להשתלה. תרביות תאים אנדותל לעתים קרובות לא לתרגם היטב במצבים vivo. בשל המאפיינים הביוקונסטרוקטיבי של הקרניות הבלתי-אנושיות, מסטרומה נפיחות במהלך הטיפוח-תרגול גורם לאובדן משמעותי של תאי הקרנית, מה שמקשה על הטיפוח-תרגול למשך זמן ממושך. סוכני deswelling כגון תוספי משמשים כדי לנטרל תגובה זו. עם זאת, הם גם גורמים לאיבוד משמעותי בתאי האנדותל. לכן, מודל תרבות vivo לשעבר האיברים אינו דורש הוקמה סוכנים. עיני חזיר מבית המטבחיים המקומי שימשו להכנת כפתורי הקרנית מפוצל. לאחר הסרת הקרנית חלקית, השכבות החיצוניות של הקרנית (אפיתל, שכבת באומן, חלקים של משתית) הוסרו. זה מפחית באופן משמעותי את האובדן של תא אנדותל הקרנית הנגרמת על ידי נפיחות מסיבית של הממברנה וקיפול הקרום של האמת לאורך תקופות הטיפוח הארוך יותר ומשפר את השימור הכללי של שכבת התא האנדותל. מעקב אחר הקרנית מלאה לאחר מכן ההסרה של כפתור הקרנית מפוצל מנורת העין הנותרים וטיפוח. צפיפות התא של האנדותל הוערך בשעות המעקב של עד 15 יום לאחר ההכנה (כלומר, ימים 1, 8, 15) במיקרוסקופ אור. טכניקת ההכנה המשמשת מאפשרת שימור טוב יותר של שכבת התא האנדותל, המופעלת על-ידי נפיחות ברקמות פחות מסטרומה, דבר הגורם לירידה איטית וליניארית בקצב הקרניות המפוצל בהשוואה לקרניות של תורמים אנושיים. כמו זה מודל אורגאנו-בדרך כלל מעובד מחקר בפעם הראשונה מאפשר טיפוח יציב לפחות שבועיים, זה חלופה רבת ערך לקרנית התורם האנושי לחקירות עתידיות של גורמים חיצוניים שונים לגבי השפעות. על האנדותל הקרנית
Introduction
השתלת הקרנית הליכים הם בין השתלות הנפוצות ביותר ברחבי העולם1. מאחר שקיים מחסור חמור בקרניות של תורמים אנושיים, מחקר ניסיוני מטפל בתאי הקרתל של הקרניות בקרנית אנושית קשה לביצוע1. עם זאת, המבוא של פתרונות השקיה וחומרים אחרים המשמשים בתוך העין, מכשירים למדידת התקשות אופטלמולוגית, כמו גם מכשירים כירורגיים וטכניקות (למשל, מכשירים וטכניקות phacoאמולסיה, אנרגיית אולטרסאונד) דורש חקירה חוקית ונרחבת בנוגע להשפעות שלהם על האנדותל הקרנית לפני שימוש קליני.
מעטים האלטרנטיבות לקרניות. התורמות של האדם למחקר מודלים מחקר בעלי חיים הם בעלי ערך רב, אבל באותו זמן מאוד משאבים רב והוא נחקר יותר ויותר מבחינה אתית. החיסרון העיקרי של תרביות תאים מבחנה הוא התרגום המוגבל שלהם לעין האנושית. התוצאות שהתקבלו מתרבויות התא יכול להיות לא מתאים בתנאים vivo, כי תאים עשויים לעבור מעבר אנדותל mesenchymal (האמבולנס), וכתוצאה מכך פיברוהפיצוץ כמו מורפולוגיה הנגרמת על ידי אובדן של קוטביות התאים ושינויים בצורת תא גן ביטוי2.
ואילו הדגמים הקודמים vivo ex דיווחו על תקופות הטיפוח של עד רק 120 h, טכניקת הכנה הרומן כדי להקים מודל הקרנית של הקרניות האנדותל של הגוף על ידי הקרנית החזיר טרי לפחות לאחר 15 ימים הוצג לאחרונה3 ,4,5,6. אם אפיתל הקרנית וחלקים של משתית מוסרים (כ 300 יקרומטר בסך הכל) מן הקרנית לפני הטיפוח, נפיחות של משתית מופחת לחצני הקרנית מפוצל וכתוצאה מכך אובדן התאים האנדותל ומתוחזק היטב שכבת התא לאחר עד 15 ימים, ואילו לחצני הקרנית לא מפוצל להראות הפסד משמעותי בתאי האנדותל בשל נפיחות סטרומה מחוספס היווצרות של קפלי האמת של. בנקים עין בדרך כלל להשתמש אוסמוטי deswelling סוכנים כגון תוספי כדי להפחית נפיחות של קרניות לפני ההשתלה. עם זאת, סוכנים אלה הוכחו לגרום לאובדן של התאיםהאנדותלמוגברת 7,8,9.
מאמר זה שואפת להמחיש מודל זה vivo ex סטנדרטית לשעבר בפרוטוקול צעד אחר צעד מפורט כדי לאפשר חוקרים עתידיים לבצע מחקר על אנדותל הקרנית באמצעות כפתורי הקרנית מפוצל. מודל זה מייצג שיטה ישירה לבדיקת חומרים וטכניקות המשמשים בתוך העין, כגון מכשירים אלסטיים, פתרונות השקיה, ואנרגיית אולטרסאונד, או הליכים אחרים שבהם מדובר באנדותל הקרנית.
Protocol
Representative Results
Discussion
פרוטוקול זה מספק שיטה להכנת כפתורי הקרנית מפוצל חזירי, אשר מייצגת מודל סטנדרטית ובעלות נמוכה לשעבר הקרנית vivo הקרתל למטרות מחקר6. Porcine לחצני הקרנית לפצל הראה ירידה של צפיפות התא האנדותל הדומה הפסדים התאים האנדותל שנצפו בקרנית התורם האנושי שטיפח בבנקים העין במשך שבועיים<sup class="x…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
הקמת מודל המחקר המוצג נתמך על ידי KMU-חדשנות (FKZ: 13GW0037F) של המשרד הפדרלי לחינוך ומחקר גרמניה.
Materials
| Subject | |||
| Pig eyes | local abbatoir | ||
| Substances | |||
| Alizarin red S | Sigma-Aldrich, USA | ||
| Culture Medium 1, #F9016 | Biochrom GmbH, Germany | ||
| Dulbecco's PBS (1x) | Gibco, USA | ||
| Fetal calf serum | Biochrom GmbH, Germany | ||
| Hydrochloric acid (HCl) solution | own production | ||
| Hypotonic balanced salt solution | own production | per 1 L of H2O: NaCl 4.9 g; KCl 0.75 g; CaCl x H2O 0.49 g; MgCl2 x H2O 0.3 g; Sodium Acetate x 3 H2O 3.9 g; Sodium Citrate x 2 H2O 1.7 g | |
| Povidon iodine 7.5%, Braunol | B. Braun Melsungen AG, Germany | ||
| Sodium chloride (NaCl) 0.9% | B. Braun Melsungen AG, Germany | ||
| Sodium hydroxide (NaOH) solution | own production | ||
| Trypan blue 0.4% | Sigma-Aldrich, USA | ||
| Materials & Instruments | |||
| Accu-jet pro | Brand GmbH, Germany | ||
| Beaker Glass 50 mL | Schott AG, Germany | ||
| Blunt cannula incl. Filter (5 µm) 18G | Becton Dickinson, USA | ||
| Cell culture plate (12 well) | Corning Inc., USA | ||
| Colibri forceps | Geuder AG, Germany | ||
| Corneal scissors | Geuder AG, Germany | ||
| Eppendorf pipette | Eppendorf AG, Germany | ||
| Eye Bulb Holder | L. Klein, Germany | ||
| Eye scissors | Geuder AG, Germany | ||
| Folded Filter ø 185 mm | Whatman, USA | ||
| Hockey knife | Geuder AG, Germany | ||
| Laboratory Glass Bottle with cap 100 mL | Schott AG, Germany | ||
| Magnetic stir bar | Carl Roth GmbH & Co. KG, Germany | ||
| MillexGV Filter (5 µm) | Merck Millopore Ltd., USA | ||
| Needler holder | Geuder AG, Germany | ||
| Petri dishes | VWR International, USA | ||
| Pipette tips | Sarstedt AG & Co., Germany | ||
| Scalpel (single use), triangular blade | Aesculap AG & Co. KG, Germany | ||
| Serological pipette 10 mL | Sarstedt AG & Co., Germany | ||
| Serological pipette 5 mL | Sarstedt AG & Co., Germany | ||
| Sterile cups | Greiner Bio-One, Österreich | ||
| Sterile gloves | Paul Hartmann AG, Germany | ||
| Sterile surgical drape | Paul Hartmann AG, Germany | ||
| Stitch scissors | Geuder AG, Germany | ||
| Suture Ethilon 10-0 Polyamid 6 | Ethicon Inc., USA | ||
| Syringe (5 mL) | Becton Dickinson, USA | ||
| trephine ø 7.5 mm | own production | ||
| Tying forceps | Geuder AG, Germany | ||
| Weighing paper | neoLab Migge GmbH, Germany | ||
| Equipment & Software | |||
| Binocular surgical microscope | Carl Zeiss AG, Germany | ||
| Camera mounted on microscope | Olympus, Japan | ||
| CellSens Entry (software) | Olympus, Japan | ||
| Cold-light source | Schott AG, Germany | ||
| Incubator | Heraeus GmbH, Germany | ||
| Inverted phase contrast microscope | Olympus GmbH, Germany | ||
| Magnetic stirrer with heating function | IKA-Werke GmbH & Co. KG, Germany | ||
| pH-meter pHenomenal | VWR International, USA | ||
| Photoshop CS2 | Adobe Systems, USA | ||
| Precision scale | Ohaus Europe GmbH, Switzerland |
References
- Gain, P., et al. Global Survey of Corneal Transplantation and Eye Banking. JAMA Ophthalmology. 134 (2), 167-173 (2016).
- Roy, O., et al. Understanding the process of corneal endothelial morphological change in vitro. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 56 (2), 1228-1237 (2015).
- Meltendorf, C., Ohrloff, C., Rieck, P., Schroeter, J. Endothelial cell density in porcine corneas after exposure to hypotonic solutions. Graefe’s Archive for Clinical and Experimental Ophthalmology. 245 (1), 143-147 (2007).
- Schroeter, J., Meltendorf, C., Ohrloff, C., Rieck, P. Influence of temporary hypothermia on corneal endothelial cell density during organ culture preservation. Graefe’s Archive for Clinical and Experimental Ophthalmology. 246 (3), 369-372 (2008).
- Schroeter, J., Ruggeri, A., Thieme, H. Impact of temporary hyperthermia on corneal endothelial cell survival during organ culture preservation. Graefe’s Archive for Clinical and Experimental Ophthalmology. 253 (5), 753-758 (2015).
- Kunzmann, B. C., et al. Establishment Of A Porcine Corneal Endothelial Organ Culture Model For Research Purposes. Cell and Tissue Banking. 19 (3), 269-276 (2018).
- Redbrake, C., et al. A histochemical study of the distribution of dextran 500 in human corneas during organ culture. Current Eye Research. 16 (5), 405-411 (1997).
- Zhao, M., et al. Poloxamines for Deswelling of Organ-Cultured Corneas. Ophthalmic Research. 48 (2), 124-133 (2012).
- Filev, F., et al. Semi-quantitative assessments of dextran toxicity on corneal endothelium: conceptual design of a predictive algorithm. Cell and Tissue Banking. 18 (1), 91-98 (2017).
- Pels, E., Schuchard, Y. Organ-culture preservation of human corneas. Documenta Ophthalmologica. 56 (1-2), 147-153 (1983).
- Borderie, V. M., Kantelip, B. M., Delbosc, B. Y., Oppermann, M. T., Laroche, L. Morphology, Histology and Ultrastructure of Human C31 Organ-Cultured Corneas. Cornea. 14 (3), 300-310 (1995).
- Linke, S. J., et al. Thirty years of cornea cultivation: long-term experience in a single eye bank. Acta Opthalmologica. 91 (6), 571-578 (2013).
- Schroeter, J., et al. Arbeitsrichtlinien – Gute Fachliche Praxis für Hornhautbanken [Procedural guidelines. Good tissue practice for cornea banks]. Ophthalmologe. 106 (3), 265-276 (2009).
- Dohlman, C. H., Hedbys, B. O., Mishima, S. The swelling pressure of the corneal stroma. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 1, 158-162 (1962).
- Xuan, M., et al. Proteins of the corneal stroma: importance in visual function. Cell and Tissue Research. 364 (1), 9-16 (2016).
- Sperling, S. Human Corneal Endothelium in Organ Culture – The Influence of Temperature and Medium of Incubation. Acta Opthalmologica. 57 (2), 269-276 (1979).
- Schroeter, J. Endothelial Evaluation in the Cornea Bank. Developments in Ophthalmology. 43, 47-62 (2009).
- Pels, E., Schuchard, Y. The Effects of High Molecular Weight dextran on the Presevation of Human Corneas. Cornea. 3 (3), 219-227 (1985).
- van der Want, H. J. L., Pels, E., Schuchard, Y., Olesen, B., Sperling, S. Electron Microscopy of Cultured Human Corneas Osmotic Hydration and the Use of dextran Fraction (dextran T 500) in Organ Culture. Archives of Ophthalmology. 101 (12), 1920-1926 (1983).
- Thuret, G., Manissolle, C., Campos-Guyotat, L., Guyotat, D., Gain, P. Animal compound-free medium and poloxamer for human corneal organ culture and Deswelling. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 46 (3), 816-822 (2005).
- Wenzel, D. A., Kunzmann, B. C., Spitzer, M. S., Schultheiss, M. Staining of endothelial cells does not change the result of cell density. Cell and Tissue Banking. 20 (2), 327-328 (2019).
- Wenzel, D. A., Kunzmann, B. C., Hellwinkel, O., Druchkiv, V., Spitzer, M. S., Schultheiss, M. Effects of perfluorobutylpentane (F4H5) on corneal endothelial cells. Current Eye Research. , (2019).
- Olsson, I. A. S., Franco, N. H., Weary, D. M., Sandøe, P. The 3Rs principle – mind the ethical gap!. ALTEX Proceedings, 1/12, Proceedings of WC8. , 333-336 (2012).
- Sanchez, I., Martin, R., Ussa, F., Fernandez-Bueno, I. The parameters of the porcine eyeball. Graefe’s Archive for Clinical and Experimental Ophthalmology. 249 (4), 475-482 (2011).
- Kim, M. K., Hara, H. Current status of corneal xenotransplantation. International Journal of Surgery. 23 (Pt B), 255-260 (2015).
- Fujita, M., et al. Comparison of Proliferative Capacity of Genetically-Engineered Pig and Human. Ophthalmic Research. 49 (3), 127-138 (2013).
