एक Porcin Corneal Endothelial अंग संस्कृति मॉडल विभाजन Corneal बटन का उपयोग
Summary
यहाँ, porcin विभाजन corneal बटन की तैयारी और खेती के लिए एक कदम दर कदम प्रोटोकॉल प्रस्तुत किया है. इस organo-आम तौर पर खेती अंग संस्कृति मॉडल के भीतर सेल मृत्यु दर से पता चलता है के रूप में 15 दिनों, मानव दाता कॉर्निया के लिए तुलनीय, यह विषाक्त डेक्सट्रान जोड़ने के बिना गैर मानव कॉर्निया की लंबी अवधि की खेती की अनुमति पहले मॉडल का प्रतिनिधित्व करता है.
Abstract
कॉर्निया endothelial कोशिकाओं पर प्रायोगिक अनुसंधान कई कठिनाइयों के साथ जुड़ा हुआ है. मानव दाता कॉर्निया दुर्लभ हैं और प्रयोगात्मक जांच के लिए शायद ही कभी उपलब्ध के रूप में वे सामान्य रूप से प्रत्यारोपण के लिए आवश्यक हैं. Endothelial सेल संस्कृतियों अक्सर अच्छी तरह से vivo स्थितियों में अनुवाद नहीं है. गैर-मानव कॉर्निया की जैव संरचनात्मक विशेषताओं के कारण, खेती के दौरान स्ट्रॉमल सूजन पर्याप्त कॉर्निया एंडोथेलियल सेल हानि लाती है, जिससे एक विस्तारित अवधि के लिए खेती करना मुश्किल हो जाता है। डेक्सट्रन जैसे डेवेलिंग एजेंटों का उपयोग इस प्रतिक्रिया को प्रतिक्रिया करने के लिए किया जाता है। हालांकि, वे भी महत्वपूर्ण endothelial सेल हानि का कारण. इसलिए, एक पूर्व vivo अंग संस्कृति मॉडल desining एजेंटों की आवश्यकता नहीं स्थापित किया गया था. एक स्थानीय कसाईखाना से सुअर आँखें विभाजित कॉर्निया बटन तैयार करने के लिए इस्तेमाल किया गया. आंशिक कॉर्निया ट्रेफिकेशन के बाद, कॉर्निया (एपिथेलियम, बोमन परत, स्ट्रोमा के कुछ हिस्सों) की बाहरी परतों को हटा दिया गया था। यह काफी लंबे समय तक खेती की अवधि के दौरान बड़े पैमाने पर स्ट्रॉमल सूजन और Descemet की झिल्ली तह द्वारा प्रेरित corneal endothelial सेल नुकसान कम कर देता है और endothelial सेल परत के सामान्य संरक्षण में सुधार. इसके बाद पूर्ण कॉर्निया ट्रेफिकेशन के बाद शेष नेत्र बल्ब और खेती से विभाजित कॉर्निया बटन को हटा दिया गया। एंडोथेलियल सेल घनत्व को तैयार करने के बाद 15 दिनों के अनुवर्ती समय पर मूल्यांकन किया गया था (यानी, दिन 1, 8, 15) प्रकाश माइक्रोस्कोपी का उपयोग करते हुए। तैयारी तकनीक का इस्तेमाल किया endothelial सेल परत कम stromal ऊतक सूजन द्वारा सक्षम का एक बेहतर संरक्षण की अनुमति देता है, जो मानव दाता कॉर्निया के लिए तुलनीय विभाजन कॉर्निया बटन में धीमी और रैखिक गिरावट दर में परिणाम. के रूप में इस मानकीकृत organo आम तौर पर पहली बार के लिए खेती अनुसंधान मॉडल कम से कम दो सप्ताह के लिए एक स्थिर खेती की अनुमति देता है, यह मानव दाता corneas के लिए विभिन्न बाहरी कारकों के भविष्य की जांच के लिए एक मूल्यवान विकल्प के साथ संबंध है उनके संबंध कॉर्निया एंडोथेलियम पर प्रभाव.
Introduction
कॉर्नियल प्रत्यारोपण प्रक्रियादुनिया में सबसे अधिक प्रदर्शन प्रत्यारोपण ों में से1हैं . चूंकि मानव दाता कॉर्निया की भारी कमी है, इसलिए मानव कॉर्निया में कॉर्निया एंडोथेलियल कोशिकाओं को संबोधित करने वाले प्रायोगिक अनुसंधान 1प्रदर्शनकरना मुश्किल है। हालांकि, सिंचाई समाधान और आंख के भीतर इस्तेमाल अन्य पदार्थों की शुरूआत, नेत्र विस्कोलोच उपकरणों, साथ ही शल्य चिकित्सा उपकरणों और तकनीकों (जैसे, phacoemulsification उपकरणों और तकनीक, अल्ट्रासाउंड ऊर्जा) की आवश्यकता है नैदानिक उपयोग से पहले कॉर्निया endothelium पर उनके प्रभाव के बारे में वैध और व्यापक जांच.
मानव दाता कॉर्निया के लिए कुछ विकल्प अनुसंधान के लिए मौजूद हैं. पशु अनुसंधान मॉडल बहुत मूल्यवान हैं, लेकिन एक ही समय में बहुत संसाधन खपत और तेजी से नैतिक रूप से पूछताछ की. इन विट्रो सेल संस्कृतियों का एक प्रमुख दोष मानव आँख के लिए उनके सीमित अनुवाद है. सेल संस्कृतियों से प्राप्त परिणाम विवो स्थितियों में असंगत हो सकते हैं, क्योंकि कोशिकाओं को एंडोथेलियल मेसेन्काइमल संक्रमण (ईएमटी) से गुजरना पड़ सकता है, जिसके परिणामस्वरूप कोशिका ध्रुवता के नुकसान और कोशिका आकार और जीन में परिवर्तन के कारण फाइब्रोब्लास्ट जैसे आकृति विज्ञान में परिणाम हो सकते हैं अभिव्यक्ति2|
जबकि पिछले पूर्व vivo मॉडल केवल 120 एच तक की खेती की अवधि की सूचना दी, एक उपन्यास तैयारी तकनीक कम से कम 15 दिनों के लिए ताजा सुअर कॉर्निया culturing द्वारा एक porcine corneal endothelial अंग संस्कृति मॉडल स्थापित करने के लिए हाल ही में शुरू किया गया था3 ,4,5,6. यदि कॉर्निया उपकला और स्ट्रोमा के कुछ हिस्सों को खेती से पहले कॉर्निया से (लगभग 300 डिग्री मीटर) हटा दिया जाता है, तो स्ट्रोमा की सूजन को विभाजित कॉर्निया बटन में कम कर दिया जाता है जिसके परिणामस्वरूप कम एंडोथेलियल सेल नुकसान और एक अच्छी तरह से बनाए रखा गया एंडोथेलियल होता है 15 दिनों तक की कोशिका परत, जबकि गैर-विभाजन कॉर्निया बटन असमान स्ट्रॉमल सूजन और Descemet की परतों के गठन के कारण महत्वपूर्ण एंडोथेलियल सेल हानि दिखाते हैं। नेत्र बैंकों आमतौर पर इस तरह के प्रत्यारोपण से पहले कॉर्निया की सूजन को कम करने के लिए डेक्सट्रन के रूप में osmotic desofin एजेंटों का उपयोग करें। तथापि, इन एजेंटों को बढ़ी हुई एन्डोथेलियल सेल हानि7,8,9को प्रेरित करने के लिए दिखाया गया था .
यह लेख एक विस्तृत कदम दर कदम प्रोटोकॉल में इस मानकीकृत पूर्व vivo अनुसंधान मॉडल कल्पना करने के लिए भविष्य जांचकर्ताओं विभाजन कॉर्निया बटन का उपयोग corneal endothelium पर अनुसंधान करने के लिए सक्षम करने के लिए करना है. इस मॉडल के पदार्थों और आंखों के भीतर इस्तेमाल किया तकनीक का परीक्षण करने के लिए एक सीधी विधि का प्रतिनिधित्व करता है, इस तरह के नेत्र चिपचिपा लोचदार उपकरणों के रूप में, सिंचाई समाधान, और अल्ट्रासाउंड ऊर्जा, या अन्य प्रक्रियाओं जहां corneal endothelium ब्याज की है.
Protocol
Representative Results
Discussion
इस प्रोटोकॉल porcin विभाजित corneal बटन है, जो अनुसंधान प्रयोजनों के लिए एक मानकीकृत और कम लागत पूर्व विवो कॉर्निया endotheal अंग संस्कृति मॉडल का प्रतिनिधित्व करता है की तैयारी के लिए एक विधि प्रदान करता है6</su…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
प्रस्तुत अनुसंधान मॉडल की स्थापना के एम यू-इनोवेटिव (एफकेजेड: 13GW0037F) द्वारा संघीय शिक्षा और अनुसंधान जर्मनी के मंत्रालय द्वारा समर्थित किया गया था।
Materials
| Subject | |||
| Pig eyes | local abbatoir | ||
| Substances | |||
| Alizarin red S | Sigma-Aldrich, USA | ||
| Culture Medium 1, #F9016 | Biochrom GmbH, Germany | ||
| Dulbecco's PBS (1x) | Gibco, USA | ||
| Fetal calf serum | Biochrom GmbH, Germany | ||
| Hydrochloric acid (HCl) solution | own production | ||
| Hypotonic balanced salt solution | own production | per 1 L of H2O: NaCl 4.9 g; KCl 0.75 g; CaCl x H2O 0.49 g; MgCl2 x H2O 0.3 g; Sodium Acetate x 3 H2O 3.9 g; Sodium Citrate x 2 H2O 1.7 g | |
| Povidon iodine 7.5%, Braunol | B. Braun Melsungen AG, Germany | ||
| Sodium chloride (NaCl) 0.9% | B. Braun Melsungen AG, Germany | ||
| Sodium hydroxide (NaOH) solution | own production | ||
| Trypan blue 0.4% | Sigma-Aldrich, USA | ||
| Materials & Instruments | |||
| Accu-jet pro | Brand GmbH, Germany | ||
| Beaker Glass 50 mL | Schott AG, Germany | ||
| Blunt cannula incl. Filter (5 µm) 18G | Becton Dickinson, USA | ||
| Cell culture plate (12 well) | Corning Inc., USA | ||
| Colibri forceps | Geuder AG, Germany | ||
| Corneal scissors | Geuder AG, Germany | ||
| Eppendorf pipette | Eppendorf AG, Germany | ||
| Eye Bulb Holder | L. Klein, Germany | ||
| Eye scissors | Geuder AG, Germany | ||
| Folded Filter ø 185 mm | Whatman, USA | ||
| Hockey knife | Geuder AG, Germany | ||
| Laboratory Glass Bottle with cap 100 mL | Schott AG, Germany | ||
| Magnetic stir bar | Carl Roth GmbH & Co. KG, Germany | ||
| MillexGV Filter (5 µm) | Merck Millopore Ltd., USA | ||
| Needler holder | Geuder AG, Germany | ||
| Petri dishes | VWR International, USA | ||
| Pipette tips | Sarstedt AG & Co., Germany | ||
| Scalpel (single use), triangular blade | Aesculap AG & Co. KG, Germany | ||
| Serological pipette 10 mL | Sarstedt AG & Co., Germany | ||
| Serological pipette 5 mL | Sarstedt AG & Co., Germany | ||
| Sterile cups | Greiner Bio-One, Österreich | ||
| Sterile gloves | Paul Hartmann AG, Germany | ||
| Sterile surgical drape | Paul Hartmann AG, Germany | ||
| Stitch scissors | Geuder AG, Germany | ||
| Suture Ethilon 10-0 Polyamid 6 | Ethicon Inc., USA | ||
| Syringe (5 mL) | Becton Dickinson, USA | ||
| trephine ø 7.5 mm | own production | ||
| Tying forceps | Geuder AG, Germany | ||
| Weighing paper | neoLab Migge GmbH, Germany | ||
| Equipment & Software | |||
| Binocular surgical microscope | Carl Zeiss AG, Germany | ||
| Camera mounted on microscope | Olympus, Japan | ||
| CellSens Entry (software) | Olympus, Japan | ||
| Cold-light source | Schott AG, Germany | ||
| Incubator | Heraeus GmbH, Germany | ||
| Inverted phase contrast microscope | Olympus GmbH, Germany | ||
| Magnetic stirrer with heating function | IKA-Werke GmbH & Co. KG, Germany | ||
| pH-meter pHenomenal | VWR International, USA | ||
| Photoshop CS2 | Adobe Systems, USA | ||
| Precision scale | Ohaus Europe GmbH, Switzerland |
References
- Gain, P., et al. Global Survey of Corneal Transplantation and Eye Banking. JAMA Ophthalmology. 134 (2), 167-173 (2016).
- Roy, O., et al. Understanding the process of corneal endothelial morphological change in vitro. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 56 (2), 1228-1237 (2015).
- Meltendorf, C., Ohrloff, C., Rieck, P., Schroeter, J. Endothelial cell density in porcine corneas after exposure to hypotonic solutions. Graefe’s Archive for Clinical and Experimental Ophthalmology. 245 (1), 143-147 (2007).
- Schroeter, J., Meltendorf, C., Ohrloff, C., Rieck, P. Influence of temporary hypothermia on corneal endothelial cell density during organ culture preservation. Graefe’s Archive for Clinical and Experimental Ophthalmology. 246 (3), 369-372 (2008).
- Schroeter, J., Ruggeri, A., Thieme, H. Impact of temporary hyperthermia on corneal endothelial cell survival during organ culture preservation. Graefe’s Archive for Clinical and Experimental Ophthalmology. 253 (5), 753-758 (2015).
- Kunzmann, B. C., et al. Establishment Of A Porcine Corneal Endothelial Organ Culture Model For Research Purposes. Cell and Tissue Banking. 19 (3), 269-276 (2018).
- Redbrake, C., et al. A histochemical study of the distribution of dextran 500 in human corneas during organ culture. Current Eye Research. 16 (5), 405-411 (1997).
- Zhao, M., et al. Poloxamines for Deswelling of Organ-Cultured Corneas. Ophthalmic Research. 48 (2), 124-133 (2012).
- Filev, F., et al. Semi-quantitative assessments of dextran toxicity on corneal endothelium: conceptual design of a predictive algorithm. Cell and Tissue Banking. 18 (1), 91-98 (2017).
- Pels, E., Schuchard, Y. Organ-culture preservation of human corneas. Documenta Ophthalmologica. 56 (1-2), 147-153 (1983).
- Borderie, V. M., Kantelip, B. M., Delbosc, B. Y., Oppermann, M. T., Laroche, L. Morphology, Histology and Ultrastructure of Human C31 Organ-Cultured Corneas. Cornea. 14 (3), 300-310 (1995).
- Linke, S. J., et al. Thirty years of cornea cultivation: long-term experience in a single eye bank. Acta Opthalmologica. 91 (6), 571-578 (2013).
- Schroeter, J., et al. Arbeitsrichtlinien – Gute Fachliche Praxis für Hornhautbanken [Procedural guidelines. Good tissue practice for cornea banks]. Ophthalmologe. 106 (3), 265-276 (2009).
- Dohlman, C. H., Hedbys, B. O., Mishima, S. The swelling pressure of the corneal stroma. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 1, 158-162 (1962).
- Xuan, M., et al. Proteins of the corneal stroma: importance in visual function. Cell and Tissue Research. 364 (1), 9-16 (2016).
- Sperling, S. Human Corneal Endothelium in Organ Culture – The Influence of Temperature and Medium of Incubation. Acta Opthalmologica. 57 (2), 269-276 (1979).
- Schroeter, J. Endothelial Evaluation in the Cornea Bank. Developments in Ophthalmology. 43, 47-62 (2009).
- Pels, E., Schuchard, Y. The Effects of High Molecular Weight dextran on the Presevation of Human Corneas. Cornea. 3 (3), 219-227 (1985).
- van der Want, H. J. L., Pels, E., Schuchard, Y., Olesen, B., Sperling, S. Electron Microscopy of Cultured Human Corneas Osmotic Hydration and the Use of dextran Fraction (dextran T 500) in Organ Culture. Archives of Ophthalmology. 101 (12), 1920-1926 (1983).
- Thuret, G., Manissolle, C., Campos-Guyotat, L., Guyotat, D., Gain, P. Animal compound-free medium and poloxamer for human corneal organ culture and Deswelling. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 46 (3), 816-822 (2005).
- Wenzel, D. A., Kunzmann, B. C., Spitzer, M. S., Schultheiss, M. Staining of endothelial cells does not change the result of cell density. Cell and Tissue Banking. 20 (2), 327-328 (2019).
- Wenzel, D. A., Kunzmann, B. C., Hellwinkel, O., Druchkiv, V., Spitzer, M. S., Schultheiss, M. Effects of perfluorobutylpentane (F4H5) on corneal endothelial cells. Current Eye Research. , (2019).
- Olsson, I. A. S., Franco, N. H., Weary, D. M., Sandøe, P. The 3Rs principle – mind the ethical gap!. ALTEX Proceedings, 1/12, Proceedings of WC8. , 333-336 (2012).
- Sanchez, I., Martin, R., Ussa, F., Fernandez-Bueno, I. The parameters of the porcine eyeball. Graefe’s Archive for Clinical and Experimental Ophthalmology. 249 (4), 475-482 (2011).
- Kim, M. K., Hara, H. Current status of corneal xenotransplantation. International Journal of Surgery. 23 (Pt B), 255-260 (2015).
- Fujita, M., et al. Comparison of Proliferative Capacity of Genetically-Engineered Pig and Human. Ophthalmic Research. 49 (3), 127-138 (2013).
